硫噴妥鈉對(duì)心肌缺血-再灌注損傷大鼠心肌Toll樣受體4和核因子-κB表達(dá)的影響

潘文星 余云明 陽興 周文 李洪軍

心肌缺血-再灌注(ischemia reperfusion，I/R)損傷是指心肌在短暫缺血時(shí)呈現(xiàn)形態(tài)、功能及代謝障礙，而恢復(fù)血流灌注后出現(xiàn)的心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變、心律失常、微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷等一系列損傷加重的現(xiàn)象[1]。內(nèi)皮細(xì)胞在維持血管正常功能中起關(guān)鍵作用，而I/R能夠通過多種機(jī)制誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)缺血性心臟病、急性心肌梗死等多種心血管疾病發(fā)展[2,3]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，心肌I/R損傷的發(fā)生常伴隨著局部或全身的炎性反應(yīng)，并且與Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)4、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)密切相關(guān)[4,5]。硫噴妥鈉(Thiopental Sodium)是一種超短時(shí)作用的臨床靜脈麻醉藥，具有作用快、呼吸道并發(fā)癥少、誘導(dǎo)期短等特點(diǎn)[6]。本研究通過構(gòu)建大鼠心肌I/R損傷模型，應(yīng)用qRT-PCR、Western blot和ELISA法，觀察了硫噴妥鈉對(duì)I/R損傷模型大鼠心肌組織TLR4、NF-κB在mRNA和蛋白水平的表達(dá)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(IL-1β)釋放的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠20只，體重250～300 g，購自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)：SCXK(滬)：2016-0006]；Neoseptin 3購自杭州光遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司；一抗、HRP標(biāo)記的二抗購自Abcam公司；TNF-αELISA試劑盒、IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；Trizol試劑、BCA試劑盒、PVDF膜、RIPA裂解液購自北京Solarbio公司；實(shí)時(shí)熒光定量引物由北京六合華大基因有限公司合成；RT-PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、購自美國(guó)Bio-Rad公司；微量核酸測(cè)定儀購自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；生物技能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)購自成都泰盟有限公司；微型動(dòng)物呼吸機(jī)購自上海奧爾科特生物公司。

1.2 I/R模型制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后禁食12 h，稱重，按0.5 ml/100 g腹腔注射20%烏拉坦。待其呼吸平穩(wěn)后，背位固定于手術(shù)臺(tái)上。將電極插入大鼠四肢皮下，連接生物機(jī)能系統(tǒng)，描記標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖，同時(shí)連接呼吸機(jī)，設(shè)定呼吸頻率為60次/min，潮氣量為1.5 ml/100 g。于心臟搏動(dòng)最明顯處，延肋骨走向剪開皮膚，暴露心臟。打開心包膜，在左冠狀動(dòng)脈前降支下穿一縫合線，打一松結(jié)，平衡10 min；松結(jié)內(nèi)墊一充水0.5 ml的球囊，結(jié)扎造成心肌缺血，心電圖ST段明顯改變?yōu)榻Y(jié)扎成功。30 min后排出球囊中的水，即刻實(shí)現(xiàn)血流再灌注，心電圖ST段明顯回落為血流再灌注成功，持續(xù)60 min，完成I/R動(dòng)物模型。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將20只健康SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組5只：假手術(shù)(sham)組、缺血+再灌注(I/R)組、缺血-再灌注+硫噴妥鈉(I/R+T)組、缺血-再灌注+硫噴妥鈉組+ TLR-4激活劑(I/R+T+Neoseptin 3)組。sham組：按100 μg/kg腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，左冠狀動(dòng)脈穿線但不結(jié)扎，觀察90 min；I/R組：腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎缺血30 min，血流再灌注60 min；I/R+T組：按60 mg/kg腹腔注射1%硫噴妥鈉注射液后30 min進(jìn)行缺血-再灌注；I/R+T+Neoseptin 3組：按60 mg/kg腹腔注射1%硫噴妥鈉和18.5 μmol/L Neoseptin 3 30 min后，進(jìn)行缺血-再灌注。

1.4 qRT-PCR 取4組大鼠心肌組織適量，充分研磨，Trizol法提取總RNA，使用微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA濃度和純度。調(diào)整RNA樣品濃度，使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒分別將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并配制反應(yīng)體系，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，每個(gè)RNA樣品重復(fù)3次。見表1。

表1 qRT-PCR引物及序列

1.5 Western blot 收集4組大鼠心肌組織剪碎，加入含蛋白酶抑制劑RIPA裂解液置于冰上裂解30 min，4℃，12 000 g離心15 min取上清。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入Ⅰ抗4℃ 孵育過夜；TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，ECL曝光顯影，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 ELISA檢測(cè)TNF-α和IL-1β水平 收集4組大鼠心肌組織剪碎，置于含蛋白酶抑制劑的預(yù)冷勻漿緩沖液中。勻漿后4℃、15 000 g離心10 min取上清，分別使用TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒、IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)大鼠心肌組織TNF-α和IL-1β水平。

2 結(jié)果

2.1 I/R對(duì)大鼠心肌組織TLR-4和NF-κB水平的影響 與sham組比較，I/R組大鼠心肌組織中TLR-4、NF-κB在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖1。

2.2 I/R對(duì)大鼠心肌組織TNF-α和IL-1β釋放的影響 經(jīng)I/R處理的I/R組大鼠心肌組織TNF-α和IL-1β水平顯著高于sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 I/R對(duì)大鼠心肌組織TLR-4和NF-κB水平的影響

圖1 大鼠心肌組織TLR-4和NF-κB蛋白電泳圖

表3 I/R對(duì)大鼠心肌組織TNF-α和IL-1β釋放的影響

2.3 硫噴妥鈉對(duì)I/R大鼠心肌組織TLR-4和NF-κB表達(dá)的影響 I/R+T組大鼠心肌組織中TLR-4、NF-κB在mRNA和蛋白水平的表達(dá)顯著低于I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 硫噴妥鈉對(duì)I/R大鼠心肌組織TLR-4和NF-κB蛋白水平的影響

2.4 硫噴妥鈉對(duì)I/R大鼠心肌組織TNF-α和IL-1β水平的影響 經(jīng)硫噴妥鈉麻醉后，I/R模型大鼠心肌組織TNF-α和IL-1β水平顯著低于I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表4 硫噴妥鈉對(duì)I/R大鼠心肌組織TLR-4和NF-κB水平的影響

表5 硫噴妥鈉對(duì)缺血-再灌注大鼠心肌組織TNF-α和IL-1β水平的影響

2.5 Neoseptin 3可逆轉(zhuǎn)硫噴妥鈉對(duì)I/R大鼠心肌損傷的抑制作用 I/R組的大鼠心肌組織TLR-4、NF-κB蛋白水平，TNF-α和IL-1β水平顯著高于sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而I/R+T組較I/R組大鼠心肌組織TLR-4、NF-κB表達(dá)水平顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TNF-α和IL-1β水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；I/R+T+Neoseptin 3組大鼠心肌組織中TLR-4、NF-κB表達(dá)及TNF-α和IL-1β水平基本恢復(fù)至I/R組水平(P<0.05)。見圖3，表6。

圖3 TLR-4和NF-κB蛋白水平的表達(dá)

3 討論

我國(guó)心血管疾病發(fā)病率和病死率呈上升趨勢(shì)，其病死率在城鄉(xiāng)居民總死亡原因中高居首位，造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，其中急性心肌梗死患者的醫(yī)療費(fèi)用占心血管疾病費(fèi)用第1位[7]。急性心肌梗死是由血流供應(yīng)急劇減少或持續(xù)性缺血導(dǎo)致的心肌壞死，同時(shí)引起心力衰竭、心律失常等并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅人體健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年我國(guó)農(nóng)村地區(qū)急性心肌梗死病死率為70.09/10萬，城市地區(qū)為56.38/10萬，糖尿病、高血壓、年齡增長(zhǎng)等是該病的危險(xiǎn)因素[8,9]。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療、靜脈溶栓治療是急性心肌梗死臨床治療的主要措施，能夠疏通患者阻塞的冠狀動(dòng)脈，恢復(fù)血流供應(yīng)，保護(hù)心臟功能，而心肌I/R損傷是急性心肌梗死再灌注治療中的一大障礙[10,11]。

表6 Neoseptin 3可逆轉(zhuǎn)硫噴妥鈉對(duì)I/R大鼠心肌損傷的抑制作用

目前普遍認(rèn)為，心肌I/R損傷發(fā)生機(jī)制與自由基、白細(xì)胞激活、細(xì)胞內(nèi)鈣超載有關(guān)：自由基同時(shí)具有還原性和氧化性，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)不能有效清除自由基時(shí)，自由基的氧化作用引發(fā)脂質(zhì)過氧化，從而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能[12]；再灌注后，細(xì)胞中鈣離子濃度增加，增強(qiáng)膜磷脂分解并降低ATP產(chǎn)生，引起細(xì)胞功能代謝障礙[13]；而白細(xì)胞在I/R前期黏附到內(nèi)皮細(xì)胞，引起毛細(xì)血管壅塞，并生成活性氧等自由基，刺激細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，加重細(xì)胞、組織的損傷[14]。此外，有研究表明，Toll樣受體(TLR)是機(jī)體免疫防御系統(tǒng)第一道防線的重要組成成分，能夠識(shí)別病原，啟動(dòng)防御系統(tǒng)，同時(shí)能識(shí)別細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答調(diào)控?fù)p傷修復(fù)[15]。據(jù)報(bào)道，脂多糖能夠促進(jìn)TLR4活化，進(jìn)而誘導(dǎo)NF-κB介導(dǎo)的炎性損傷[16]。NF-κB是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，與免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)等生物過程有關(guān)，能夠刺激TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)炎性反應(yīng)[17]。多項(xiàng)研究表明，抑制TLR4表達(dá)和NF-κB活性，對(duì)缺血再灌注或慢性應(yīng)激引起的心肌損傷具有保護(hù)作用[18,19]。本研究通過構(gòu)建大鼠心肌I/R損傷模型并采用qRT-PCR、Western blot和ELISA法檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)I/R損傷模型大鼠心肌組織中TLR4和NF-κB在mRNA和蛋白水平的表達(dá)顯著上調(diào)，TNF-α和IL-1β水平顯著升高。

據(jù)報(bào)道，麻醉藥具有心肌保護(hù)作用，能夠通過調(diào)節(jié)一氧化氮合活性氧生成、維持細(xì)胞內(nèi)鈣平衡等改善I/R引起的心肌功能障礙[20]。Yan等[21]研究發(fā)現(xiàn)，乳化異氟醚可通過增強(qiáng)超氧化物歧化酶活性、降低丙二醛含量發(fā)揮心肌保護(hù)作用；Steurer等[22]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)揮發(fā)性麻醉劑七氟醚預(yù)處理后，心肌組織中肌鈣蛋白T、肌酸激酶顯著降低；Galagudza等[23]研究發(fā)現(xiàn)，異氟醚、戊巴比妥、苯二氮卓類等藥物均對(duì)I/R損傷的小鼠心肌具有保護(hù)作用。而硫噴妥鈉在I/R引起的腎損傷中，能夠抑制過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性的降低，從而保護(hù)腎臟[24]；并對(duì)胎鼠腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用[25]；但硫噴妥鈉在心肌I/R損傷中的作用暫無相關(guān)報(bào)道。本文通過使用硫噴妥鈉預(yù)處理后建立大鼠心肌I/R損傷模型，發(fā)現(xiàn)大鼠心肌組織中TLR4和NF-κB表達(dá)及TNF-α和IL-1β水平顯著下降；但使用TLR-4激活劑處理后，TLR4和NF-κB表達(dá)及TNF-α和IL-1β水平回升。

綜上所述，硫噴妥鈉能夠通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路降低炎性細(xì)胞因子分泌，對(duì)心肌缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用。提示，使用硫噴妥鈉預(yù)處理后進(jìn)行再灌注治療可減輕心肌損傷，這一結(jié)果有望為克服心肌缺血再灌注損傷提供新靶點(diǎn)。