Ghrelin 預處理骨髓間充質(zhì)干細胞來源上清液對內(nèi)皮細胞增殖、遷移及凋亡的影響

葛珊慧，張莉珊，林 山，曾 勉

（中山大學1.附屬第一醫(yī)院內(nèi)科重癥監(jiān)護室；2.呼吸病研究所，廣東廣州 510080）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是臨床上常見的一種高死亡率疾病，其臨床特點為短期進展的呼吸困難、低氧血癥（PaO2/FIO2≤300 mmHg）及滲透性肺水腫［1-2］，其發(fā)病機制復雜，而肺毛細血管內(nèi)皮細胞受損是ARDS 發(fā)生的重要事件［3］。間充質(zhì)干細胞（mesen?chymal stem cells，MSCs）是一種具有多向分化潛能及自我更新能力的成體干細胞，是組織工程及再生醫(yī)學的種子細胞。研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可通過其旁分泌途徑減輕脂多糖（LPS）誘導的急性肺損傷［4-5］。生長激素釋放肽（ghrelin）是生長激素釋放激素受體的內(nèi)源性配體，研究顯示其參與調(diào)節(jié)食物攝入、能量代謝、肌肉萎縮、骨代謝以及細胞增殖與凋亡等病理生理過程［6-7］，近年來研究指出，ghrelin 對MSCs 存在某些調(diào)控作用，如Abda?nipour 等［8］發(fā)現(xiàn)ghrelin 可顯著促進MSCs 的增殖活力，Han等［9］指出ghrelin可通過激活PI3K/AKT通路減輕MSCs 的凋亡，增強其在缺氧狀態(tài)下的存活能力，提高其對缺血性心臟病的治療效果。這種ghrelin對MSCs調(diào)控作用是否同樣也能夠增強其對急性肺損傷（acutelunginjury，ALI）的治療效果，具體的作用機制是什么？這些問題目前尚未清楚，因此，本研究通過觀察在ghrelin 預處理BMSCs 來源的上清液中培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞的增殖、遷移及凋亡情況探討ghrelin 預處理后BMSCs 對內(nèi)皮細胞的作用，為治療ALI/ARDS提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物 3 周齡，SPF 級雄性Sprague Dawley大鼠（平均體質(zhì)量50 g），由中山大學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2016-0029，本實驗經(jīng)中山大學附屬第一醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準，實驗過程對動物處理符合動物倫理學要求。

1.1.2 實驗試劑 低糖DMEM培養(yǎng)基（c11885500bt）、高糖DMEM培養(yǎng)基（c11995500bt）、胎牛血清（Gibco公司，美國）、青霉素?鏈霉素雙抗（Thermo Fisher）、2.5 g/L EDTA 胰酶（Thermo Fisher）、CCK8 細胞增殖毒性檢測試劑盒（東仁（DOJINDO），CK04）、Ghrelin?human（Tocris）、脂多糖（來源于大腸桿菌0127：B8，貨號L3129，Sigma?Aldrich 公司）、流式表面分子抗體：Anti?Mouse/Rat CD29（eBioscience）、Anti?Mouse/Rat CD90.1（eBioscience）、FITC Mouse Anti?Rat CD45（BD Pharmingen）；Annexin V?FITC/PI 雙染細胞凋亡試劑盒（BD Pharmingen）、Anti?甘油醛?3?磷酸脫氫酶（glyceraldehyde?3?phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（cell Signaling Tech?nology）、Anti?Bax 抗體（cell Signaling Technology）、Anti?caspase3（cell Signaling Technology）、Anti?β?catenin 抗體（cell Signaling Technology）、SDS?PAGE凝膠配制試劑盒（Beyotime）、RIPA 裂解液（強）、PMSF 試劑（Beyotime）、NuPAGE LDS Sample Buffer（4×）上樣緩沖液（Thermo Fisher）、電泳液（自配）、轉(zhuǎn)膜液（自配）、磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline（PBS），自配）、TBST 緩沖液（自配）、含2%牛血清白蛋白PBS 溶液（PBA，自配）、PVDF 膜（0.45 μm，Merck millipore 公司）、特超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒（Beyotime）。

1.1.3 實驗儀器 超凈工作臺，CO2培養(yǎng)箱（Ther?mo Fisher）、低溫高速離心機（Eppendorf 公司）、化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)（ImageQuant Las4000mini）、流式細胞儀（CytoFLEX，BECHMAN COULTER）、全自動倒置熒光顯微鏡（Leica DMi8）、酶標儀（Sunrise）、電泳儀（Bio?Rad）、轉(zhuǎn)膜裝置。

1.2 間充質(zhì)干細胞提取、培養(yǎng)與鑒定

1.2.1 大鼠BMSCs 的提取與培養(yǎng) 本實驗沿用之前課題組采用的全骨髓貼壁分離法［10］提取大鼠BMSCs。取3 周齡SD 大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉處死后將大鼠放進75%乙醇浸泡5 min，在超凈工作臺內(nèi)用高壓滅菌過的手術(shù)器械分離脛骨、股骨，用無菌PBS 沖洗骨髓至發(fā)白，將骨髓懸液收集至15 mL離心管，300×g離心5 min，棄去上清，用含10%胎牛血清低糖DMEM 完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，吹打混勻后轉(zhuǎn)移至25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%體積分數(shù)CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，24 h 后顯微鏡下觀察可見大量漂浮圓形細胞，為大鼠骨髓中的血紅細胞，換液，去除漂浮的血細胞，此后2～3 d 換1 次液，直至細胞融合80%～90%，可進行傳代。

1.2.2 大鼠BMSCs 的流式鑒定 胰酶消化BMSCs（P3），300×g離心5 min，棄上清液，預冷PBA 1 mL洗滌細胞一次，加入100 μL PBA重懸細胞，用槍頭輕輕吹打混勻，4℃避光孵育30 min，然后用預冷PBA 離心洗滌兩次，以除去未結(jié)合的多余抗體成分，最后用100 μL PBA 重懸細胞，吹打混勻，置于流式管中，上機檢測（測量終濃度1×106/100 μL）。

1.3 內(nèi)皮細胞培養(yǎng)

本實驗采用人EA.hy926 細胞（人臍靜脈內(nèi)皮細胞與人肺腺癌細胞A549 融合細胞）作為替代模擬肺泡內(nèi)皮細胞，EA.hy926 細胞從American Type Culture Collection 獲取，具有內(nèi)皮細胞的生物學特性，用含100 mL/L 胎牛血清高糖DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃，5%體積分數(shù)CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 BMSCs 上清液的提取

取處于對數(shù)生長期的第3代BMSCs，待細胞貼壁后分別加入高、中、低濃度ghrelin（100、10、1、0 nmol/L），24 h 后換為無血清低糖DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后取上清液，離心后取上清備用。

1.5 CCK8 測定BMSCs 上清對內(nèi)皮細胞增殖能力的影響

內(nèi)皮細胞（EA.hy926）以2 000/孔接種于96 孔板中，待細胞貼壁后棄去原培養(yǎng)基，加入各組BMSCs 上清液100 μL 培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL CCK8 溶液，37 ℃孵育2 h 后于酶標儀450 nm 處測量吸光度（OD 值）。

1.6 劃痕試驗評估BMSCs 上清對內(nèi)皮細胞遷移能力的影響

在六孔板背面用marker 筆每隔0.5～1 cm 畫一橫線，取各組對數(shù)生長期EA.hy926 細胞接種于六孔板，待六孔板細胞長至約90%融合后，用200 μL無菌槍頭，垂直于橫線畫線，每孔至少穿過5 條線，劃痕完成后，用無菌PBS 洗細胞3 次，洗去不貼壁細胞，使劃線后留下的痕跡清晰可見，最后加入1 mL 各組BMSCs 上清液，細胞放入37 ℃，體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，然后在0 h，24 h 顯微鏡下觀察并測量劃痕之間的面積，并拍照，結(jié)果使用Image J 軟件分析。

1.7 BMSCs 上清對脂多糖誘導EA.hy926 凋亡的影響

EA.hy926 接種于六孔板，待細胞長至70～80%融合后，加入1 mL 各組BMSCs 上清液，同時加入脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導凋亡，培養(yǎng)24 h 后進行后續(xù)處理分析。

1.7.1 流式細胞計數(shù)分析凋亡細胞數(shù)量 上述各組細胞加不含EDTA 胰酶消化后，300 ×g離心5 min，用預冷PBS緩沖液洗滌細胞一次，然后加入300 μL 的1X binding buffer 懸浮細胞，再加入5 μL的Annexin V?FITC 避光，室溫孵育15 min，上機前5 min 再加入5 μL 的PI（碘化丙啶，Propidium Iodide）染色，然后用CytoFLEX 流式細胞儀分析早期及晚期凋亡情況。

1.7.2 western blot分析各組蛋白的表達情況 上述各組細胞用強RIPA 裂解液裂解后，4 ℃14 000×g離心10 min，取上清，用BCA 法測定各組蛋白濃度，加入上樣緩沖液后于95 ℃變性15 min；每孔蛋白上樣量取30 μg，10%SDS?PAGE 凝膠電泳后進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完成后用2%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液封閉PVDF 膜1 h，TBST緩沖液洗滌3 次，每次5 min，分別加GAPDH（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、caspase3（1∶1 000）、β?catenin（1∶1 000）一抗4 度孵育過夜，TBST 緩沖液洗滌3 次，每次10 min，加二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST 緩沖液洗滌3 次，加ECL 發(fā)光液顯影，蛋白條帶結(jié)果使用image J 軟件分析。

1.8 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 作統(tǒng)計學分析，呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以四分位數(shù)M（P25～P75）表示。多組比較，當數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊時，采用單因素方差分析（One?way ANOVA），方差分析有統(tǒng)計學意義時，兩兩比較采用LSD?t檢驗。當數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布或方差不齊時，則采用Kruskal Wallis H 檢驗進行統(tǒng)計分析，兩兩比較采用Bonferroni 法。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs 形態(tài)及鑒定

利用全骨髓貼壁法提取BMSCs，多次傳代提純以后懸浮細胞大大減少，鏡下可見P3 BMSCs 貼壁生長，形態(tài)均勻一致，呈紡錘形（圖1），流式抗體鑒定BMSCs 表面分子可見，細胞高表達CD29（99.78%±0.19%）、CD90（98.92%±0.94%）表面抗原，而低表達造血干細胞相關(guān)的表面抗原CD45（4.92%±0.20%），符合間充質(zhì)干細胞的生物學特性，可用于后續(xù)實驗（圖2）。

圖1 光鏡下大鼠BMSCs（P3）形態(tài)（40×）Fig.1 The third generation of rat BMSCs in vitro（40×）

圖2 BMSCs 表面標志物表達情況Fig.2 Expression of Surface markers in BMSCs

2.2 梯度濃度ghrelin 預處理BMSCs 上清液對內(nèi)皮細胞增殖能力影響

本實驗采用CCK8 法檢測內(nèi)皮細胞的活力，如圖3 所示，與無血清處理組相比，BMSCs 上清可以增強內(nèi)皮細胞活力，而相較于未給予ghrelin預處理的BMSCs，100 nmol/L ghrelin 預處理BMSCs能促進內(nèi)皮細胞的增殖，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3 梯度濃度ghrelin 預處理BMSCs 上清液對內(nèi)皮細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果（圖4）顯示，對照組及各實驗組之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。具體而言，與無血清處理組（33.87±1.94）%相比，BMSCs（54.37±3.52）%、1 nmol/L ghrelin+BMSCs（60.37±5.95）%、10 nmol/L ghrelin+BMSCs（69.83±3.67）%、100 nmol/L ghrelin+BMSCs（73.70±2.10）%組24 h面積修復率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而與BMSCs處理組相比，10、100 nmol/L ghrelin 預處理BMSCs組內(nèi)皮細胞遷移能力增強，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），10 nmol/L ghrelin 預處理BMSCs組與100 nmol/L ghrelin 預處理BMSCs 組24 h 面積修復率未見統(tǒng)計學差異（P>0.05）。

2.4 梯度濃度ghrelin 預處理BMSCs 上清液對LPS 誘導內(nèi)皮細胞凋亡的影響

圖3 CCK8 檢測內(nèi)皮細胞活力Fig.3 Analysis of cell viability of endothelial cells by cell counting kit?8

流式細胞術(shù)是一種常見的檢測細胞凋亡情況的手段，利用AnnexinV 及PI 雙染法標記凋亡細胞，可以直觀地了解細胞凋亡比例。結(jié)果如圖5所示，空白對照組總凋亡率為（6.60±1.07）%，加入脂多糖誘導損傷后總凋亡率為（49.91±1.66）%，兩組之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示脂多糖（LPS）可以誘導內(nèi)皮細胞凋亡。與損傷組相比，BMSCs+LPS 組（41.11±1.83）%、1 nmol/L ghrelin+BMSCs+LPS 組（40.64±1.52）%、10 nmol/L ghrelin+BMSCs+LPS 組（38.92±2.26）%及100 nmol/L ghre?lin+BMSCs+LPS 組（34.51±3.51）%總凋亡率均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明BMSCs 可以減輕LPS 誘導的內(nèi)皮細胞凋亡程度。而與BM?SCs+LPS 組相比，只有100 nmol/L ghrelin+BM?SCs+LPS 組細胞凋亡率明顯降低（P<0.05），提示高濃度ghrelin 預處理后的BMSCs 能更明顯地降低LPS 誘導的內(nèi)皮細胞凋亡水平。

2.5 梯度濃度ghrelin 預處理BMSCs 上清液對內(nèi)皮細胞相關(guān)蛋白表達的影響

Western blot 實驗結(jié)果（圖6）表明，LPS 處理后內(nèi)皮細胞凋亡蛋白Bax 及caspase 3 和β?catenin 的表達水平明顯升高（P<0.05），而100 nmol/L ghrelin預處理BMSCs 能夠顯著降低上述蛋白的表達水平（P<0.05）。

圖4 內(nèi)皮細胞遷移能力Fig.4 Migration ability of endothelial cells

圖5 流式細胞術(shù)分析內(nèi)皮細胞凋亡率Fig.5 Analysis of endothelial cells′apoptosis rates with flow?cytometry

3 討論

目前ARDS 病死率仍居高不下，大約為35%～46%，而其治療手段主要依靠抗感染及對癥治療，缺少針對發(fā)病機制的治療方法［11］。各種致病因子對肺泡上皮細胞及肺泡微血管內(nèi)皮細胞的損傷導致的“血?氣屏障”被破壞是ARDS 發(fā)生的關(guān)鍵，由LPS 或TNF?α、IL?1 等促炎因子介導的免疫細胞應(yīng)答紊亂，進而促炎/抗炎反應(yīng)失衡、瀑布式炎癥反應(yīng)發(fā)生，炎癥反應(yīng)過程所產(chǎn)生的活性氧、蛋白酶及細胞因子等可以破壞肺微血管內(nèi)皮細胞的完整性與通透性，導致凝血狀態(tài)異常及微血栓形成［12-13］，因此抑制肺泡內(nèi)皮細胞凋亡及炎癥反應(yīng)是治療ARDS 的一個研究方向。BMSCs 作為一種來源廣泛、易于獲得的多能干細胞，其分泌的一些細胞因子、生長因子及生物活性因子能夠起到減輕炎癥反應(yīng)、修復損傷組織及免疫調(diào)節(jié)作用［14-15］，目前已經(jīng)有許多研究報道了間充質(zhì)干細胞來源的外泌體或者細胞培養(yǎng)上清對ARDS 肺泡血管內(nèi)皮細胞的治療價值［16-18］，我們的實驗結(jié)果也證實了這一點，將來源于BMSCs 的上清液與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)可以增強內(nèi)皮細胞活力及遷移能力，并減輕脂多糖誘導的細胞凋亡。

圖6 免疫印跡法檢測內(nèi)皮細胞蛋白表達情況Fig.6 Analysis of protein expression of endothelial cells with western blot

ghrelin—生長激素釋放激素受體的內(nèi)源性配體，與肺損傷修復及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。我們課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)ghrelin 通過降低肺泡巨噬細胞［19］及肺泡上皮細胞［20］凋亡減輕膿毒癥肺損傷。Ye 等［21-22］發(fā)現(xiàn)，生長激素釋放激素受體（GHSR）在BMSCs 上高表達，ghrelin 通過與GHSR 結(jié)合激活ERK1/2通路促進BMSCs 增殖、成骨分化及成軟骨分化，也有研究指出，ghrelin 預處理MSCs 能夠增強其對缺血性心臟病的治療效果［9］，因此，ghrelin可能通過結(jié)合BMSCs 上的GSHR 改變了BMSCs 的某些生物特性，從而影響了BMSCs 的治療效果。本實驗利用梯度濃度ghrelin 預處理BMSCs 來源上清液與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)，探索其對內(nèi)皮細胞增殖、遷移及凋亡的影響，結(jié)果提示高濃度（100 nmol/L）ghrelin 預處理能夠增強BMSCs 促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移以及抗脂多糖誘導細胞凋亡的能力。由此我們猜測，ghrelin 預處理BMSCs 可能促進其分泌某些生物因子，從而改善內(nèi)皮細胞的功能，但具體是什么成分起到了作用，需要進一步的研究。

Wnt/β?catenin 通路調(diào)控細胞增殖與凋亡、炎癥及免疫反應(yīng)［23-24］，是機體生長發(fā)育的重要信號通路之一。β?連環(huán)蛋白（β?catenin）是Wnt/β?catenin途徑的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄共激活因子，研究發(fā)現(xiàn)其參與胚胎肺發(fā)育［25］，肺組織損傷修復［26］，肺纖維化［27］等肺部病理生理過程。為了進一步探索ghrelin預處理BMSCs 減輕LPS 誘導內(nèi)皮細胞凋亡的具體機制，我們對內(nèi)皮細胞β?catenin 蛋白水平進行了檢測。本實驗結(jié)果顯示，LPS 處理后內(nèi)皮細胞β?catenin 蛋白表達上調(diào)，而100 nmol/L ghrelin 預處理BMSCs 能夠下調(diào)內(nèi)皮細胞中β?catenin 蛋白的表達水平，同時細胞凋亡蛋白Bax、caspase 3 表達降低，流式細胞術(shù)結(jié)果也證實ghrelin 預處理BM?SCs 可使內(nèi)皮細胞凋亡率下降。Villar 等［28］研究指出Wnt/β?catenin 通路在膿毒癥誘導肺損傷早期即激活，參與肺損傷后的異常修復及肺纖維化過程。實際上，Wnt/β?catenin 通路在調(diào)控細胞凋亡及炎癥反應(yīng)方面起到了重要作用，研究發(fā)現(xiàn)，β?catenin蛋白在細胞凋亡時表達上調(diào)，下調(diào)β?catenin 蛋白表達及抑制Wnt/β?catenin 通路激活可以減輕細胞凋亡以及降低細胞中促炎因子IL?6，IL?8，TNF?α等表達水平，減輕LPS 誘導的炎癥反應(yīng)［29-30］。我們的結(jié)果也顯示ghrelin 預處理BMSCs 減輕了脂多糖誘導的內(nèi)皮細胞損傷，同時下調(diào)了β?catenin蛋白的表達，與上述研究一致。因此，我們認為ghrelin 預處理BMSCs 可能通過抑制Wnt/β?catenin通路的激活來減輕LPS 誘導的內(nèi)皮細胞凋亡。

綜上，本研究結(jié)果提示，ghrelin 預處理BMSCs上清液能增強肺泡血管內(nèi)皮細胞的活力及遷移能力，改善脂多糖誘導的內(nèi)皮細胞凋亡，其中減輕脂多糖誘導的內(nèi)皮細胞凋亡作用可能與下調(diào)β?catenin 表達、抑制Wnt/β?catenin 通路激活有關(guān)，但具體是BMSCs 上清液的何種成分，具體如何調(diào)控Wnt/β?catenin 通路的上游分子如p?GSK3β、GSK3β及下游靶基因Axin2，Cyclin D1 和Cyclin E1等，后續(xù)實驗將進一步探討。