HDST技術(shù)應(yīng)用于卵巢癌新輔助化療中的效果分析

饒群仙 ，韋 苑，林少丹，彭永排，林榮春，何遠橋，林仲秋，陳青松

（1.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院婦科腫瘤?？疲瑥V東廣州 510120；2.廣東藥科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東廣州 510310；3.南昌大學(xué)實驗動物科學(xué)中心//南昌樂悠生物科技有限公司，江西南昌 330000）

卵巢癌作為女性最常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢［1］。因其缺乏典型癥狀及有效的篩查方法，難以實現(xiàn)早期診斷且具有種植和遠處轉(zhuǎn)移的特點［2］。超過70.0%的卵巢癌直到發(fā)展到晚期才被診斷［3］。研究表明卵巢癌的5 年存活率僅為47.4%［4］，死亡率居婦科腫瘤第二位［5］，歷來被稱為“沉默的殺手”［6］。近年來研究報道晚期卵巢癌患者的最佳治療方法是以腫瘤細胞減滅術(shù)聯(lián)合紫杉醇+鉑類（卡鉑及順鉑為主）的一線新輔助化療（NACT）方案，腫瘤組織的異質(zhì)性與原發(fā)性或繼發(fā)耐藥是影響腫瘤療效的關(guān)鍵因素［7］。Vaughan 等［8］研究表明卵巢癌組織的化療敏感性、反應(yīng)預(yù)測因子和治療耐藥機制上存在的個體異質(zhì)性導(dǎo)致患者間的化療效果存在差異。近年來研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌的原發(fā)性耐藥的發(fā)生率約為15.0%～25.0%［9］，大多數(shù)卵巢癌治療后復(fù)發(fā)，并最終發(fā)展成耐藥［10］。因此，可以認為卵巢癌的預(yù)后取決于是否及時診斷和系統(tǒng)的治療［11］，而指南推薦的化療方案無法解決患者個體異質(zhì)性以及耐藥性的難題。通過評估化療敏感性，可促進個體化治療方案的優(yōu)化［12］，以克服和限制耐藥性的發(fā)展［13］，改善預(yù)后。目前國內(nèi)外積極開展腫瘤培養(yǎng)藥敏檢測，體內(nèi)藥敏檢測受技術(shù)復(fù)雜、價格昂貴、實驗周期長等因素影響，藥敏檢測主要以細胞生物學(xué)實驗等體外檢測為主。水凝膠包被的腫瘤組織培養(yǎng)藥敏檢測法（hydrogel embedded histoculture drug sensitivity test，HDST），簡稱HDST 技術(shù)，是借鑒國外先進技術(shù)，研究探索出來一種新型腫瘤組織體外藥敏快速檢測方法，相對于四氮唑鹽比色法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、組織塊培養(yǎng)法（histoculture drug response assay，HDRA）、三磷酸腺苷生物發(fā)光法（ATP tumor chemosensitivity assay，ATP-TCA）、基因分型、耐藥基因分析法等檢測方法，其在篩選腫瘤化療藥物上具有快速方便、經(jīng)濟實惠、可行性高等顯著特點。近年來，HDST 技術(shù)在我國開始臨床試驗，研究發(fā)現(xiàn)HDST 與咽喉腫瘤臨床化療方案的療效具有較好的相關(guān)性［14］，但該技術(shù)在國內(nèi)外卵巢癌的研究中仍處于空白階段。本研究應(yīng)用HDST 在卵巢癌個體化化療中的作用，探究HDST 在卵巢癌個體化新輔助化療方案選擇中的意義，以改善晚期卵巢癌患者的預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究回顧性分析2019 年10 月至2020 年1月于廣州市中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院婦科腫瘤?？剖罩蔚?1 例按照NCCN 指南推薦行新輔助化療的Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者，收集患者的社會人口學(xué)資料、病理學(xué)及手術(shù)記錄、影像學(xué)、腫瘤標(biāo)記物等臨床資料。本研究經(jīng)患者知情同意，并報送我院倫理委員會審批通過。研究對象按新輔助化療中HDST 藥敏有效率進行分組，其中A 組（有效率<30.0%）、B 組（有效率30.0%～60.0%）、C 組（有效率≥60.0%）。分析不同組別的CA125、HE4、Fagotti評分指標(biāo)變化的差異，探討HDST 有效率與化療療效的關(guān)系。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者初次手術(shù)行腹腔鏡或剖腹探查術(shù)或穿刺活檢，組織學(xué)診斷符合2014 年FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期；②患者術(shù)后行3 次新輔助化療后再行間歇性腫瘤細胞減滅術(shù)；③術(shù)中切除腫瘤組織行HDST 技術(shù)檢測；④治療前已完善胸片、腹部彩超、陰道超聲、CT、腫瘤標(biāo)記物等檢查；⑤所有患者心肝腎功能無明顯異常，無化療禁忌癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者除化療外接受其他類型的輔助治療，如靶向治療、放療、內(nèi)分泌治療等；②未完成3 次規(guī)范化新輔助化療療程。

1.3 HDST 技術(shù)

將腫瘤患者術(shù)中切除的腫瘤組織切割成微小組織塊，經(jīng)腫瘤標(biāo)本采集，腫瘤樣本處理，組織塊接種，藥物處理，敏感性檢測和結(jié)果分析，分析時根據(jù)吸光度值換算公式將孔板各孔的吸光度值進行換算，進而計算出每種藥物對腫瘤組織塊活性的影響。依據(jù)MTS 比色法藥物敏感性檢測判斷標(biāo)準(zhǔn)定義抑制率≥30.0%為有效藥物，抑制率<30.0%則判定為無效藥物。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣本的采集及處理 ①樣本的采集：手術(shù)切除下來的新鮮卵巢癌腫瘤樣本離體后盡快取材（15 min 以內(nèi)）。標(biāo)本離體后用預(yù)冷生理鹽水清洗，然后放入裝有預(yù)冷的組織保存液的離心管中。低溫2℃～8℃條件下4 h 內(nèi)運輸至實驗室（切勿冷凍），存于細胞實驗室生物安全柜。②腫瘤組織處理：在細胞實驗室生物安全柜內(nèi)將腫瘤組織進行活性鑒定、修整、消毒和清洗后分割成2 × 2× 2 mm 的組織塊，96 孔細胞培養(yǎng)板每1 個孔內(nèi)放1 塊分割好的組織塊，細胞培養(yǎng)板放在冰板上預(yù)冷。

1.4.2 組織的體外培養(yǎng) ①組織塊接種：將一定量的水凝膠溶液（80 μL，96 孔細胞培養(yǎng)板）加入到在含有組織塊的細胞培養(yǎng)孔中，淹沒全部組織塊，蓋上蓋子后放入37 ℃，體積分數(shù)5%二氧化碳含量的細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，待水凝膠凝固后，將培養(yǎng)板取出在生物安全柜里加入適量的組織培養(yǎng)基（100 μL/孔），再放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②藥物處理：組織塊培養(yǎng)24 h 候后吸棄原來的組織培養(yǎng)基，加入含有測試藥物的新鮮組織培養(yǎng)基，每24 h 更換一次含有測試藥物的完全培養(yǎng)基。

1.4.3 藥物敏感性檢測 給藥3 d 后吸棄含藥培養(yǎng)基，用PBS 洗滌3 次，然后加入MTS 溶液孵育6 h，從裝有組織塊的細胞培養(yǎng)板中的每個板孔中吸取100 μL 溶液，把吸取的溶液加入新的細胞培養(yǎng)板的孔板中，使用酶標(biāo)儀檢測每孔的吸光度值。

1.4.4 藥敏檢測結(jié)果判定 根據(jù)算式A=abc，將各孔吸光度值進行換算，計算每種藥物對腫瘤組織塊活性的影響。其中a 為吸光系數(shù)［單位為L/（g·cm）］，b 為光在樣本中經(jīng)過的距離（通常為比色皿的厚度，單位為cm），c 為溶液濃度（單位為g/L）。酶標(biāo)儀檢測490 nm 波長處的OD 值。藥物抑制率=（1-D藥物組/D對照組）×100%。實驗重復(fù)3 次，取平均值［14］。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）進行描述，非正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)和四分位數(shù)［M（P25～P75）］描述，計數(shù)資料用例數(shù)n進行描述。采用kappa檢驗一致性，采用Spearman′s 秩相關(guān)分析。所有檢驗均為雙側(cè)，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 基本情況

本研究共收集11 例晚期卵巢癌患者。研究對象年齡位于55～69 歲之間，臨床分期以ⅢC 期為主。經(jīng)評估所有患者均可耐受化療，所有患者進行剖腹/腹腔鏡探查/活檢，共10 例進行了探查手術(shù)，以評估是否能進行初次滿意腫瘤細胞減滅術(shù)，其中腹腔鏡探查6 例，開腹探查4 例，余1 例行腹水穿刺活檢后確診；病理類型以高級別漿液性癌為主，占9 例，低級別漿液性癌和低分化腺癌各1 例。隨著新輔助化療次數(shù)的增長，腫瘤標(biāo)志物CA125 與HE4 均呈現(xiàn)明顯的逐次下降趨勢。完成3 次新輔助化療后，患者CA125（U/mL）從化療前的1 181.2（564.3～2 750.0）降至25.5（14.9～63.6），HE4（pmol/L）從1 317.0（212.4～1 488.0）降至108.8（65.7～376.8），而化療后Fagotti評分從8.0（4.0～8.0）分降至2.0（0.0～2.0）分（表1）。

2.2 患者HDST 藥敏結(jié)果

11 例患者均嚴格按照NCCN 指南的推薦制定的以紫杉醇-鉑類聯(lián)合化療的新輔助化療方案。根據(jù)HDST 藥敏結(jié)果，11 例患者中有8 例在化療過程中使用HDST 結(jié)果中敏感性最高的推薦首選化療藥；6 例患者對選用的鉑類藥（順鉑或卡鉑）不敏感，1 例對紫杉醇不敏感。采用的化療藥中至少一半以上的藥物是有效的患者共6 人，其中僅3 例患者選用全部敏感的化療藥（表2）。

2.3 HDST 結(jié)果與臨床療效的一致分析

HDST 技術(shù)判定化療藥物是否有效的結(jié)果與患者實際的臨床療效結(jié)果的一致性較好（Kappa=1.000，P<0.05；表3）。HDST 技術(shù)在預(yù)測卵巢癌患者臨床療效方面的靈敏度、特異度和正確指數(shù)為100.0%?；贖DST的結(jié)果，對于化療過程中使用了HDST 提示不敏感（有效率<30.0%）的藥物的患者，預(yù)測臨床療效為無效的準(zhǔn)確率達100.0%。

表1 患者基本情況及臨床特征Table 1 Basic information and clinical characteristics of patients

2.4 HDST有效率與患者腫瘤指標(biāo)變化的相關(guān)分析

隨著新輔助化療次數(shù)的增長，A 組患者HE4、CA125 水平出現(xiàn)不降反升現(xiàn)象，其他組患者的腫瘤標(biāo)志物CA125 及HE4 的累積下降率均呈現(xiàn)逐次升高（圖1），8 例B、C 組（有效率≥30.0%）患者在完成3 次新輔助化療后腫瘤標(biāo)志物水平恢復(fù)正常，B、C 組患者腫瘤標(biāo)志物總下降率比A 組患者高1～2倍，且Fagotti 評分下降率超過70.0%（表4）。經(jīng)Spearman′s 秩相關(guān)分析，患者Fagotti 評分變化和HDST 有效率間存在顯著正相關(guān)（rs=0.678，P<0.05），而CA125、HE4 總下降率和HDST 有效率間無相關(guān)（P>0.05）。

3 討論

卵巢癌由于早期發(fā)病并無明顯典型臨床特征，難以實現(xiàn)早期診斷，不利于卵巢癌患者的治療。卵巢癌相關(guān)的高死亡率在很大程度上歸因于晚期診斷和耐藥性［15］。目前認為晚期卵巢癌患者的最佳治療方法是以腫瘤細胞減滅術(shù)聯(lián)合以紫杉醇+鉑類（卡鉑及順鉑為主）為基礎(chǔ)的一線新輔助化療（NACT）方案［16］，以達到降低腫瘤負荷，提高手術(shù)效果，改善預(yù)后的目的。我們的研究發(fā)現(xiàn)晚期卵巢癌患者在按NCCN 指南推薦選擇一線“最佳”方案進行的新輔助化療過程中出現(xiàn)耐藥的情況，6 例患者選用指南推薦卻自身不敏感的鉑類藥（順鉑或卡鉑），1 例患者對紫杉醇不敏感。這與前人研究報道的15.0%～25.0%的卵巢癌原發(fā)性耐藥率［9］，其中初治患者25.0%的原發(fā)性鉑類耐藥率［17］相比，本研究中一線鉑類藥的耐藥比例更高，這可能是與本研究樣本量較少相關(guān)。但無可否認的是，由于耐藥性的存在，完全根據(jù)指南推薦制定的化療方案并不是患者最優(yōu)的“治療配方”?；诼殉舶┥腥庇行У脑缙诤Y查手段，有效的藥敏檢測技術(shù)以指導(dǎo)制定患者個體化化療方案，將明顯改善患者預(yù)后。

表2 患者HDST 結(jié)果及臨床用藥方案Table 2 Patients′HDST results and clinical medication regimen

表3 HDST 結(jié)果與臨床療效的一致性分析Table 3 Analysis of consistency between HDST results and clinical efficacy

表4 三組患者腫瘤標(biāo)記物及Fagotti 評分下降率變化情況Table 4 Changes of tumor markers and Fagotti scores in patients of the three groups（%）

圖1 三組患者CA125、HE4 及Fagotti 評分下降趨勢Fig.1 Declining trend of CA125，HE4 and Fagotti scores in patients of the three groups

本研究研究對象選擇11 例晚期（Ⅲ/Ⅳ期）行3 療程新輔助化療的卵巢上皮性腫瘤患者，新輔助化療臨床療效評估提示10 例有效，1 例無效。如上文所述，由于腫瘤異質(zhì)性和腫瘤微環(huán)境的影響，若不能恰當(dāng)?shù)睾Y選敏感度高的藥物治療及時控制病情進展，不但會耽誤患者病情，延長病程，細胞毒性化療藥的不當(dāng)使用還可能導(dǎo)致不必要的毒副作用，誘導(dǎo)耐藥等不良預(yù)后。

為了探究HDST 技術(shù)在新輔助化療中應(yīng)用的可靠性，我們對基于患者HDST 藥敏情況判定的療效結(jié)果與臨床療效的一致性分析發(fā)現(xiàn)，HDST 藥敏是否有效與臨床療效判定結(jié)果之間一致性較好（Kappa=1.000，P<0.05），HDST 技術(shù)在預(yù)測卵巢癌患者臨床療效方面的靈敏度、特異度高。此外，比較3 組患者腫瘤觀察指標(biāo)變化情況（圖1），可能受樣本量的限制及Spearman′s 秩相關(guān)較低的檢驗功效的影響，本研究中尚未能證明腫瘤標(biāo)志物下降率與HDST 藥敏有效率間的相關(guān)性，但我們發(fā)現(xiàn)了有效率與Fagotti 評分指標(biāo)存在正相關(guān)（rs=0.678，P<0.05）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，無效組中有一例患者采用NCCN 指南推薦的多西他賽聯(lián)合順鉑或卡鉑化療方案進行新輔助化療過程中出現(xiàn)腫瘤進展。HDST 結(jié)果顯示該患者對一線藥順鉑和卡鉑幾乎無效，而對紫杉醇和洛鉑敏感。因此，調(diào)整該患者化療方案為紫杉醇聯(lián)合洛鉑化療2 次后，腫瘤標(biāo)記物均降至正常，且隨訪半年無復(fù)發(fā)。從按指南推薦的方案化療后無效的化療療效，到基于HDST 結(jié)果調(diào)整方案化療后的病情改善，提示即使存在個體差異和腫瘤異質(zhì)性，根據(jù)HDST技術(shù)確實可為患者精準(zhǔn)治療提供依據(jù)，有助于臨床醫(yī)生在眾多一線化療藥物中篩選出病患的個體化精準(zhǔn)方案，改善患者預(yù)后。

值得一提的是，本研究也意外發(fā)現(xiàn)一例繼發(fā)耐藥的患者，其活檢時首次HDST 結(jié)果顯示對紫杉醇、卡鉑及順鉑等一線藥敏感度高于60.0%，3 次新輔助化療后，IDS 術(shù)中再次取病理組織進行二次HDST 檢測發(fā)現(xiàn)一線化療藥的敏感度均降低，甚至已發(fā)展為對卡鉑及順鉑耐藥，而對洛鉑的敏感度也不佳（僅33.0%）。短短間隔3 個月的兩次HDST 檢測結(jié)果的變化提示晚期患者的耐藥性處于持續(xù)進展，這與其他研究的結(jié)果一致。即大多數(shù)患初始治療良好，治療后會出現(xiàn)復(fù)發(fā)或最終發(fā)展成耐藥的情況［10］。基于患者動態(tài)進展的藥敏情況，僅一次HDST 檢測尚不能滿足臨床醫(yī)生全程掌控病情進展的需求。因此，HDST 技術(shù)應(yīng)用于晚期卵巢癌患者新輔助化療中若能實現(xiàn)多次檢測，效果更佳。

HDST 技術(shù)的優(yōu)勢得益于其利用水凝包被的微組織培養(yǎng)技術(shù)提供的三維空間結(jié)構(gòu)，保持了組織的活性和腫瘤的微環(huán)境［18-19］，且在篩選腫瘤化療藥物上3～7 d 即可及時提供檢測結(jié)果，而建立人源腫瘤異種移植（patient-derived xenografts，PDX）模型就需要2～4 個月［19］。這不但彌補了目前PDX 等檢測耗時長、費用高［7］缺點，同時其結(jié)果判讀方法借鑒成熟的MTT 法，藥敏結(jié)果與臨床化療方案療效相關(guān)性高［20］，檢測的結(jié)果符合臨床應(yīng)用的指南推薦化療方案，具有快速方便、經(jīng)濟實惠、可行性高等顯著特點。

基于HDST 的優(yōu)勢，在癌癥化療方案的篩選上可快速有效地提供一定的幫助。然而，HDST 也具有一定的局限性。作為一種體外化療藥物篩選方法，對于環(huán)磷酰胺這類需經(jīng)肝臟活化后發(fā)揮抗腫瘤作用的前體藥物的抗癌效果無法直接評估［14］。另外，PARP 抑制劑等靶向口服藥已用于卵巢癌維持治療［21］，而HDST 對于靶向口服藥物的檢測數(shù)據(jù)還在持續(xù)積累中。本研究還存在樣本少的缺陷，我們正在開展更大樣本的研究，同時對卵巢癌患者進行長期隨訪及統(tǒng)計分析，以了解根據(jù)HDST 結(jié)果選擇化療方案的患者的生存優(yōu)勢，為今后卵巢癌患者尤其是原發(fā)性耐藥的卵巢癌患者依據(jù)藥篩結(jié)果進行個體化精準(zhǔn)化療提供理論依據(jù)。

HDST 藥敏檢測法在卵巢癌的新輔助化療方案篩選上具有快速方便、經(jīng)濟實惠，結(jié)果與臨床療效一致的優(yōu)勢，有望為卵巢癌患者提供精準(zhǔn)的個體化化療方案。