基于羧基功能化碳球的溶菌酶固定化和表面印跡研究

劉文倩，許 亮，錢立偉，徐甜甜，陳昊楠，張素風

(陜西科技大學 輕化工程國家級實驗教學示范中心 陜西省造紙技術(shù)及特種紙品開發(fā)重點實驗室 教育部輕化工助劑化學與技術(shù)重點實驗室，陜西 西安 710021)

0 引言

近十幾年來，在生物技術(shù)和生命科學領(lǐng)域，大量的研究致力于蛋白質(zhì)藥物的研發(fā)、醫(yī)學診斷以及基于蛋白質(zhì)組學的重大疾病發(fā)病機制的探究，在這些研究中，蛋白質(zhì)的純化、分離與檢測至關(guān)重要[1].為了實現(xiàn)目標蛋白質(zhì)的分離或分析，基于抗體-抗原特異性識別作用的方法是被認為最有效的方法，如免疫親和色譜和酶偶聯(lián)免疫吸附劑分析.然而，抗體的篩選與生產(chǎn)十分復(fù)雜，其成本較高，穩(wěn)定性差，不易貯存，所以價格十分昂貴[2].因此，研究廉價、穩(wěn)定、可反復(fù)使用的識別分離材料來取代生物抗體非常重要.

其中，以蛋白質(zhì)為模板的分子印跡技術(shù)被認為是最有希望的一種方法[3].分子印跡技術(shù)是創(chuàng)造一種對模板分子在形狀、大小以及官能團具有相互匹配功能的識別性材料的過程，合成的分子印跡聚合物(Molecularly Imprinted Polymers,MIPs)對模板分子具有較高的親和力和選擇性[4-6].MIPs是通過聚合物中構(gòu)筑與模板分子形狀、大小以及官能團具有相互匹配功能的印跡孔穴，來實現(xiàn)對特定蛋白的識別.在分子印跡領(lǐng)域中，以小分子為模板的分子印跡技術(shù)發(fā)展較為成熟[7-9]，與之相比，以生物大分子為模板，特別是蛋白質(zhì)分子，由于其龐大的分子體積使得高識別性蛋白印跡材料的制備依然面臨許多挑戰(zhàn).

近些年來，將模板固定化法與表面印跡技術(shù)結(jié)合的蛋白MIPs制備策略成為熱點[10].這是因為：(1)通過蛋白的固定化，使其位于基質(zhì)材料表面相似位置與高度，因而有利于實現(xiàn)印跡層厚度與識別性、模板洗脫能力之間的規(guī)律調(diào)控；(2)通過調(diào)節(jié)基質(zhì)表面官能團種類和數(shù)目，可有效增強蛋白的固載量，從而提高蛋白MIPs中印跡孔穴數(shù)目與識別性.我們研究的意義是尋求一種簡單高效的、適用于蛋白質(zhì)等大分子的印跡策略，為蛋白質(zhì)等大分子的純化、分離與檢測提供新的思路和方法.

分子印跡技術(shù)被認為是在模板存在下，功能單體與交聯(lián)劑共聚制備人工受體的最有利技術(shù)之一，然而，相較于印跡效果良好的小分子模板，生物大分子蛋白由于具有結(jié)構(gòu)易變性、分子尺寸大和復(fù)雜的表面結(jié)構(gòu)等特性，其成功的印跡仍面臨許多挑戰(zhàn).針對這些問題，設(shè)計了多種策略來解決這些局限性，如原位印跡，微接觸印跡和表面印跡.在這些方法中，表面印跡技術(shù)近年來受到了越來越多的關(guān)注.

本文采用模板固定化策略和表面印跡技術(shù)相結(jié)合的方法，選用蛋白負載量高的碳納米微球用于蛋白固定化作為分子印跡聚合物的載體，選擇聚合可控、能發(fā)生自聚合作用的多巴胺為功能單體來印跡蛋白質(zhì)，固定化策略可以使目標蛋白定向富集在材料表面，得到的印跡孔穴較為規(guī)整，表面印跡技術(shù)使其印跡空穴位于表面，利于模板蛋白的傳質(zhì)過程，最終得到對目標蛋白具有高識別性能、良好吸附性量的印跡識別材料.

1 實驗部分

1.1 實驗原料及儀器

(1)主要原料

實驗所有原料及試劑見表1所示.

表1 材料、試劑及其規(guī)格

(2)主要儀器

傅里葉紅外光譜儀，德國布魯克Bruker；掃描電子顯微鏡，捷克TESCAN；X射線光電子能譜分析儀，英國島津；紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；Zeta電位測定儀，德國Mutek；SDS-PAGE凝膠電泳儀，北京六一儀器廠.

1.2 實驗方法

1.2.1 羧基功能化碳納米微球的制備(CFCs)

先將3 g葡萄糖溶解在30 mL去離子水中，然后加入不同濃度(相對于葡萄糖劑量為0 wt%、1 wt%、2 wt%、5 wt%、10 wt%和20 wt%)的丙烯酸.然后將反應(yīng)混合物在190 ℃的條件下加水熱處理5 h，得到的物料用水和乙醇洗兩次，在60 ℃的條件下于真空條件下烘干，獲得的樣品[11].

1.2.2 蛋白印跡聚合物的制備(CFC@MIPs)

為制備溶菌酶表面印跡微球，首先將0.04 g CFCs在溶菌酶濃度為1.2 mg/mL的10 mL Tris-HCl緩沖液(0.01 M，pH 8.5)中孵育，室溫下攪拌30 min，得到預(yù)反應(yīng)溶液.接下來，將0.2 g多巴胺添加到溶液中在25 ℃下反應(yīng)40 min.所得產(chǎn)品被混合溶液的2%(v/v)醋酸和2%(w/v)SDS去除模板,直到紫外線分光光度計在280 nm沒有探測到吸附的蛋白質(zhì)信號.所得到的印跡聚合物(CFC@MIPs)用水和乙醇洗滌數(shù)次，最后在60 ℃真空干燥備用.作為參考，非印跡聚合物(CFC@NIPs)以與CFC@MIPs相同的方法制備，但不添加模板蛋白.

1.2.3 溶菌酶濃度-吸光度標準曲線的繪制

以水作溶劑，配制0.1～1.2 mg/L不同濃度的溶菌酶水溶液，以水作參比，測定各濃度溶液在最大吸收波長(280 nm)下的紫外吸收強度，并繪制溶菌酶濃度-吸光度(Abs)標準曲線[12].

1.2.4 吸附實驗表征

(1)吸附量計算

將測定的上清液的紫外吸光度在濃度-紫外吸收標準曲線上標定，計算上清液蛋白質(zhì)濃度，用式(1)計算溶菌酶吸附量[13,14].

(1)

式(1)中：q-吸附量，mg/g；C0-初始濃度，mg/L；Ct-吸附后的濃度mg/L；V-體積，L；m-吸附劑質(zhì)量，g.

(2)吸附動力學

為了研究顆粒的吸附動力學，將10 mg的CFC@MIPs(NIPs)懸浮于含10 mL 1.1 mg/mL的溶菌酶磷酸鹽緩沖液(0.01 M，pH7.0)中.按規(guī)定時間間隔，在25 ℃下孵育10～110 min，從溶液中離心樣品.用紫外可見分光光度計在280 nm檢測波長下測定了殘液中溶菌酶的濃度，并用準一級和準二級模型對數(shù)據(jù)進行擬合，以得到最合適的描述.

(3)吸附等溫線

在吸附等溫實驗中，使用不同初始濃度的溶菌酶進行了測試，從0.1～1.2 mg/mL在25 ℃下孵化110 min后，離心分離后，用紫外可見分光光度計在280 nm檢測波長下測定了上清液中溶菌酶的濃度，并用Langmiur和Freundlich模型對數(shù)據(jù)進行擬合，以得到最合適的描述.

(4)選擇性吸附

在選擇性吸附實驗中，將25 mg CFC@MIP(NIPs)添加到離心管中，該離心管中含有25 mL 濃度為1.1 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液.在溫育110 min后，將溶液通過離心分離，并使用紫外可見分光光度計測量上清液中蛋白質(zhì)的濃度.

(5)競爭吸附

在競爭性吸附實驗中，有10 mg顆粒放入10 mL磷酸鹽緩沖液(0.01 M，pH 7.0)中，每種濃度的BSA和溶菌酶的蛋白質(zhì)混合物1.0 mg/mL，在25 ℃下.孵育120 min后，將顆粒用2%(v/v)乙酸和2%(w/v)SDS的混合溶液洗滌去除模板蛋白直到紫外可見分光光度計在280 nm處檢測不到蛋白吸附信號.合并蛋白洗脫液，并使用帶有分子截止值為500 Da透析，然后冷凍干燥.將獲得的產(chǎn)物溶于3 mL磷酸鹽緩沖液(0.01 M，pH 7.0)，并使用12.5%聚丙烯酰胺分離凝膠和5%聚丙烯酰胺堆積凝膠進行SDS-PAGE測量.

2 結(jié)果與討論

本研究以葡萄糖為原料，以水熱碳化制備的碳納米微球為蛋白印跡的載體，以多巴胺作為功能單體和交聯(lián)劑，將模板蛋白固定化策略與表面印跡技術(shù)相結(jié)合，制備了溶菌酶印跡核殼碳微球.在MIPs的制備過程中，通過調(diào)節(jié)丙烯酸的用量和多巴胺的聚合時間，可以方便地控制碳微球基質(zhì)上羧基的含量和印跡聚合物的厚度.因此，制備的溶菌酶印跡微球在理論上可以表現(xiàn)出優(yōu)異的識別能力和良好的吸附性能.

2.1 以碳納米微球為載體的蛋白印跡聚合物的表征

2.1.1 丙烯酸添加量對蛋白固定量的影響

對于羧基功能化碳微球基質(zhì)，丙烯酸用量是控制其表面電荷、形貌和蛋白固定化能力的重要參數(shù).如圖1所示，隨著丙烯酸用量從0～2 wt%的增加，CFCs的負表面電荷顯著增加.但碳球上溶菌酶的固定化量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在2 wt%的丙烯酸用量下，最大固定化量約為59 mg/g.這可能是由于丙烯酸的過量，會導(dǎo)致羧基功能化碳納米微球之間的交聯(lián)和粘附，從而減少了基體中結(jié)合位點的數(shù)量.

圖1 丙烯酸添加量對碳球表面電荷和蛋白固定化影響

2.1.2 形貌表征

圖2所示的SEM圖像顯示了CFCs、CFC@MIPs和CFC@NIPs的形態(tài)學特征.如圖2(a)～(c)所示，CFCs、CFC@MIPs和CFC@NIPs的SEM證實了單分散納米顆粒具有明確的球形形狀和300～500 nm范圍內(nèi)的平均粒徑.此外，圖2(b)、(c)的SEM圖像顯示，與CFCs相比，CFC@MIPs和CFC@NIPs均表現(xiàn)出團聚現(xiàn)象，這可能是由于碳球表面包覆了一層聚多巴所導(dǎo)致的.此外，由于碳球基體的電子密度與印跡層相近，而印紋層的厚度又很薄，因此很難對印跡層厚度的準確厚度進行評估.

(a)CFCs

2.1.3 結(jié)構(gòu)表征

由圖3(a)全反射紅外光譜圖可以看出，與CFCs相比CFC@MIPs和CFC@NIPs在3 400 cm-1左右的峰變寬，這是由于PDA中羥基吸附水和氨基重疊造成的；此外，在1 506 cm-1和1 645 cm-1分別對應(yīng)于CFC@MIPs和CFC@NIPs中PDA苯基C=C拉伸和N-H彎曲的典型特征峰[15]，證明多巴胺成功包覆于碳納米微球上，成功制備了蛋白印跡材料和非印跡材料.采用XPS法對印跡聚合物的表面化學成分進行了表征，通過XPS分析確定了0～1 200 eV范圍內(nèi)的碳(C)、氧(O)和氮(N)元素.

如圖3(b)所示，CFCs中沒有氮的信號，但是在DA自聚合后，N峰值出現(xiàn)在CFC@MIPs和CFC@NIPs中的400.84 eV處，這與PDA中氮元素所對應(yīng)，進而說明了CFC@MIPs和CFC@NIPs的成功合成.

(a)FT-IR圖

2.2 溶菌酶印跡聚合物吸附性能表征

2.2.1 溶菌酶濃度-吸光度(Abs)標準曲線

通過紫外分光光度法測得溫度為25 ℃,pH值為7時，不同濃度下溶菌酶水溶液的吸光度，從而制得溶菌酶溶液-吸光度(Abs)標準曲線，對曲線進行線性擬合，如圖4所示，標準曲線擬合后方程表示為y=2.293 6x+0.073 2,R2=0.998 4.

圖4 溶菌酶濃度-吸光度(Abs)標準曲線

2.2.2 多巴胺聚合時間對印跡效果的影響

在表面印跡技術(shù)中，印跡層的厚度是影響MIPs識別能力的重要因素，因此本文研究了多巴胺聚合時間對CFC@MIPs識別的影響[16-18].如圖5所示，聚合時間不到40 min的時候,識別能力CFC@MIPs隨著反應(yīng)時間的增加而顯著增加,表明聚多巴胺層的增厚的初始階段聚合有利于建設(shè)更完整的印跡腔，從而達到更好的識別能力.但隨著聚合時間的延長，CFC@MIPs的識別能力下降.這可能是由于印跡層太厚，這很容易導(dǎo)致模板分子包埋難以洗脫，減少了印跡腔的數(shù)量.因此，為了獲得最佳的識別能力，選擇40 min的聚合時間作為制備CFC@MIPs的最佳反應(yīng)條件.

圖5 多巴胺聚合時間對印跡效果的影響

2.2.3 吸附動力學研究

為了確定接觸時間對吸附容量的影響，分別對CFC@MIPs和CFC@NIPs微球的吸附動力學進行了評價.如圖6所示，在1～100 min內(nèi)，印跡微球的吸附速度比非印跡微球更快.這表明，CFC@MIPs和溶菌酶之間的相互作用明顯強于CFC@NIPs，這很可能是印跡微球內(nèi)存在溶菌酶形狀的印跡孔穴.吸附100 min后，CFC@MIPs和CFC@NIPs的吸附速率均逐漸降低，說明微球內(nèi)外部環(huán)境的驅(qū)動力降低.此外，值得注意的是，印跡和非印跡微球均能在110 min內(nèi)達到平衡，這可能與表面印跡技術(shù)制備的吸附劑傳質(zhì)阻力低有關(guān).因此，在接下來的吸附研究中，CFC@MIPs和CFC@NIPs接觸時間均選擇了110 min.

圖6 不同接觸時間內(nèi)CFC@MIPs和CFC@NIPs吸附性能對比

為了進一步研究CFC@MIPs的吸附和識別行為，建立了準一級動力學模型和準一級動力學模型對數(shù)據(jù)進行擬合，以期得到最適合的描述.準一級模型與準二級模型公式如式(2)、(3)所示[19，20]：

ln(Qe-Qt)=lnQe-k1t

(2)

(3)

式(2)、(3)中：Qe(mg/g)和Qt(mg/g)分別為平衡時刻和不同時刻對應(yīng)的吸附容量.k1(min-1)和k2(mg·g-1min-1)分別是準一級和準二級吸附速率常數(shù).準一階模型描述了吸附位點的占用率與未占據(jù)位點的數(shù)量成正比，而準二階模型則是吸附質(zhì)與吸附質(zhì)的化學吸附量的總和.

CFC@MIPs在溫度為25 ℃，pH值為7時，對濃度為1.1 mg/g的溶菌酶吸附動力學準一級和準二級動力學擬合結(jié)果如圖7和圖8所示，擬合結(jié)果總結(jié)如表1所示.

圖7 CFC@MIPs和CFC@NIPs的準一級吸附動力學模型擬合

圖8 CFC@MIPs和CFC@NIPs的準二級吸附動力學模型擬合

表1 吸附動力學擬合參數(shù)

如表1所示，CFC@MIPs和CFC@NIPs的偽二階模型與實驗數(shù)據(jù)擬合較好，R2值比偽一階模型高，表明吸附可能是由于化學吸附.此外，CFC@MIPs的Qe值明顯大于CFC@NIPs，說明它們對溶菌酶有良好的印跡作用.

2.2.4 等溫吸附研究

為了研究初始濃度對吸附容量和識別能力的影響，對MIPs和NIPs樣品進行吸附等溫線實驗.從圖9可以看出，隨著溶菌酶濃度從0.1增加到1.0 mg/mL，CFC@MIPs的吸附量迅速增加，在1.1 mg/mL以上達到了71 mg/g的飽和吸附能力.另外，CFC@MIPs吸附的溶菌酶量明顯高于CFC@NIPs，1.1 mg/mL溶菌酶溶液的最大IF值也達到3.3.在隨后的吸附實驗中，選擇溶菌酶濃度為1.1 mg/mL，識別效果最佳.

圖9 溶菌酶不同初始濃度下CFC@MIPs(NIPs)吸附性能對比

為了進一步研究CFC@MIPs和CFC@NIPs對溶菌酶的吸附和識別機制，分別采用Langmuir模型和Freundlich模型對吸附等溫曲線進行分析.Langmuir等溫線模型假設(shè)吸附發(fā)生在特定的均相位點和單層吸附，每個位點只能吸附一個分子，而Freundlich等溫線模型適用于非均相表面的多層吸附.這些模型表示如式(4)、(5)所示[21，22]

(4)

(5)

式(4)、(5)中：qm(mg/g)和Kl(mL/mg)分別為理論最大吸附容量和結(jié)合極限的Langmuir常數(shù).Kf(mg/g)是與吸附能力有關(guān)的Freundlich常數(shù).

CFC@MIPs和CFC@NIPs在溫度為25 ℃，pH值為7時，對不同濃度的溶菌酶吸附Langmuir模型結(jié)果如圖10所示.它們在溫度為25 ℃，pH值為7時，對不同濃度的溶菌酶吸附Freundlich模型結(jié)果如圖11所示，擬合結(jié)果如表2所示.

圖10 CFC@MIPs和CFC@NIPs的Langmuir吸附等溫模型擬合

圖11 CFC@MIPs和CFC@NIPs的Freundlich吸附等溫模型擬合

如表2所示，與Freundlich模型擬合結(jié)果相比，CFC@MIPs和CFC@NIPs的實驗數(shù)據(jù)與Langmuir模型擬合較好，R2都大于0.98，說明兩種材料對溶菌酶的吸附過程類似于單分子層吸附，并且材料中的吸附位點分布較為均勻，進一步證實了CFC@MIPs中存在溶菌酶大小的印跡空腔.

表2 吸附等溫線擬合參數(shù)

2.2.5 選擇性吸附實驗

選擇幾種蛋白包括卵清白蛋白(Mw=43 kDa，pI=4.5)，牛血紅蛋白(Mw=65 kDa，pI=6.9)，牛血清白蛋白(Mw=66.4 kDa，pI=4.8)和細胞色素C(Mw=13 kDa，pI=10.8)作為參比蛋白，以研究CFC@MIPs和CFC@NIPs對溶菌酶的識別能力.如圖12所示，CFC@MIPs可以選擇性地吸附溶菌酶，印跡因子可達3.3.但是，仍然可以觀察到有一些牛血紅蛋白和細胞色素C與MIPs結(jié)合，這可能是由于π-π堆積，氫鍵和蛋白質(zhì)和聚多巴胺層之間的靜電相互作用.此外，與牛血紅蛋白和細胞色素C相比，CFC@MIPs吸附牛血清白蛋白和卵清白蛋白的容量更少，說明兩者之間存在較強的靜電排斥作用[23].

圖12 選擇性吸附實驗

2.2.6 競爭吸附

通過競爭吸附實驗進一步研究了MIPs在蛋白混合溶液中對溶菌酶的識別能力.從圖13可以看出，在SDS-PAGE分析中，泳道4的兩條明顯的條帶顯示了NIPs可以通過非特異性吸附提取牛血清白蛋白(Mw=66.4 kDa，pI=4.8)和溶菌酶(Mw=14.4 kDa，pI=11.2).然而，與NIPs相比，只在泳道3中發(fā)現(xiàn)了一條條帶，且顏色更深，而在14.4 kDa處代表溶菌酶，進一步說明MIPs表現(xiàn)出了良好的特異性識別能力.從SDS-PAGE分析結(jié)果可以推斷，CFC@MIPs納米顆粒具有大量與模板蛋白溶菌酶互補的印跡空腔.

條帶1為蛋白質(zhì)Marker；條帶2為溶菌酶和牛血清白蛋白的混合蛋白溶液：條帶3和4分別為從CFC@MIPs和CFC@NIPs中得到的洗脫蛋白圖13 SDS-PAFE凝膠電泳分析

3 結(jié)論

對基于羧基功能化的碳納米微球為載體的蛋白印跡聚合物通過掃描電子顯微鏡(SEM)、X射線光電子能譜分析儀(XPS)和傅里葉紅外光譜儀(FT-IR)進行了物理和化學性能檢測及分析，可以證實多巴胺成功包覆于羧基功能化碳納米微球表面，成功制備了溶菌酶蛋白印跡聚合物.

吸附實驗結(jié)果證明，在溫度為25 ℃、pH為7的環(huán)境下，該印跡納米材料對目標蛋白有較高的吸附能力，吸附量為71 mg/g，快速平衡時間為110 min，溶菌酶印跡聚合物的吸附動力學數(shù)據(jù)符合準二級動力學模型，等溫吸附數(shù)據(jù)符合Langmuir模型，吸附屬于化學單層吸附，且對目標蛋白有較好的選擇性，印跡因子可達3.3.