分散液液微萃取-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法測定生物樣品中艾司西酞普蘭

（山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 晉中 030600）

艾司西酞普蘭（escitalopram）是丹麥Lunbeck公司研發(fā)的5-羥色胺再攝取抑制藥，于2002年在瑞典上市，為消旋體西酞普蘭的S-對映異構(gòu)體，是新一代抗抑郁藥[1]，有研究[2-3]報(bào)道其不僅抗抑郁作用顯著，而且具有較好的抗焦慮作用，因此被臨床上廣泛用于治療抑郁癥，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。由于抑郁癥患者本身就可能出現(xiàn)自傷、自殺或產(chǎn)生自殺企圖，在使用此類藥物治療期間自殺事件時(shí)有發(fā)生。因此，中毒生物檢材中艾司西酞普蘭的檢測尤為重要，不僅可在企圖自殺事件中為臨床搶救治療提供合理方案，也可在中毒案件中為法醫(yī)偵破案件提供充分的證據(jù)，有必要對其建立高靈敏度、高準(zhǔn)確度、方便、高效的檢測方法。

圖1 艾司西酞普蘭的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of escitalopram

目前，艾司西酞普蘭的檢測方法主要有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[4]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[5]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）[6]。生物檢材中艾司西酞普蘭的樣品前處理過程中常采用液液萃取，此法耗時(shí)，需要大量有機(jī)溶劑，也有采用固相萃取手段，但成本較高，操作繁瑣[7-9]。而離子液體分散液相微萃取是基于離子液體、分散劑和水的三元混合體系的樣品前處理方法，富集效率高、快速簡便，是一種環(huán)境友好和安全的萃取技術(shù)，被越來越廣泛地應(yīng)用于樣品前處理中[10-11]。由于離子液體對有機(jī)物和無機(jī)物的溶解度高、蒸汽壓低，與許多有機(jī)溶劑不混溶，大大減少了有機(jī)溶劑的使用[7]。本研究采用離子液體作為新型萃取劑，擬建立一種簡單、方便、節(jié)省有機(jī)溶劑、環(huán)境友好且萃取率較高的超聲輔助離子液體-分散液液微萃取-GC-MS/MS聯(lián)用法以檢測生物樣品中艾司西酞普蘭。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

7890B-7000C氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有G4513A自動(dòng)進(jìn)樣器，美國Agilent公司），VORTEX-GENIE 2旋渦混合器（美國Scientific Industries公司），Research? plus單道移液器（德國Eppendorf公司），SB-5200DTD超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），Neofuge15R高速冷凍離心機(jī)[力新儀器（上海）有限公司]，Simplicity 185超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

艾司西酞普蘭標(biāo)準(zhǔn)品（99.9%，北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司）；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[C4MIM][PF6]）、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[C6MIM][PF6]）、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[C8MIM][PF6]）純度均為99%，購自中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所；甲醇、乙腈均為色譜純，丙酮為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 樣品制備方法

空白血液和肝組織樣本均來自健康家兔（山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心）。

分別精密量取50 μL質(zhì)量濃度為10 μg/mL的艾司西酞普蘭標(biāo)準(zhǔn)品、100 μL[C6MIM][PF6]離子液體、850μL超純水，加入預(yù)先裝有100μL血液（或0.1g肝組織勻漿）的1.5mL聚四氟乙烯尖底離心管中，渦旋30 s，后加入250 μL乙腈溶液，渦旋30 s。超聲4 min后，置于4℃冷凍離心機(jī)中以1556×g離心5min，然后將微量進(jìn)樣器輕輕插入下層離子液體中央，將吸取的下層液體置于1.5mL離心管中，用乙腈按體積比為1∶10進(jìn)行稀釋，1μL進(jìn)樣，供GC-MS/MS檢測。

1.3 儀器條件

色譜條件：HP-5MS UI毛細(xì)管柱（30m×0.25mm，0.25 μm）；載氣為氦氣（純度99.999%）；流速1 mL/min；升溫程序?yàn)槌跏紲囟?00℃，保持1.50 min，以25℃/min升至280℃，保持5 min；分流進(jìn)樣，分流比1∶10；進(jìn)樣量1μL，掃描起始時(shí)間2min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（electron impact，EI）離子源，電離能量70eV，離子源溫度230℃，接口溫度250℃；質(zhì)量掃描范圍（m/z）30～500，溶劑延遲3min；采用多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，所選擇的母離子質(zhì)荷比為324，子離子質(zhì)荷比分別為86（定量離子）和58，碰撞能量分別為5.00、6.00eV。

1.4 方法學(xué)驗(yàn)證

本研究對所建立檢測方法的選擇性、線性、檢出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantification，LOQ）、精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證[12]，并應(yīng)用于實(shí)際案例。

選擇性：取10份不同來源的空白血液和肝組織，按1.2節(jié)方法進(jìn)行樣品制備、1.3節(jié)方法進(jìn)行樣品分析。要求空白基質(zhì)中含有的物質(zhì)對待測物的檢測沒有干擾。

線性：取空白檢材（血液100μL、肝組織0.1g）各6份，配制質(zhì)量濃度為5.56、11.11、55.56、111.11、555.56和 1 111.10 ng/mL（或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.025、0.05、0.25、0.50、2.50和5.00mg/g）的艾司西酞普蘭加標(biāo)樣品，每個(gè)濃度平行3次。然后按1.2節(jié)方法進(jìn)行樣品制備、1.3節(jié)方法進(jìn)行樣品分析。以艾司西酞普蘭含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，建立線性回歸方程。

LOD和LOQ：取空白檢材（血液100 μL、肝組織0.1 g）各7份，分別添加不同質(zhì)量濃度的艾司西酞普蘭儲(chǔ)備液，配制成質(zhì)量濃度為2.00、4.00、6.00、8.00、10.00、12.00和14.00ng/mL的血液樣品以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2.00、4.00、6.00、8.00、10.00、12.00 和 14.00 μg/g的肝組織樣品。按1.2節(jié)方法進(jìn)行樣品制備、1.3節(jié)方法進(jìn)行樣品分析。以信噪比（S/N）≥3時(shí)的樣品最低濃度為LOD，以S/N≥10時(shí)的樣品最低濃度為LOQ。

精密度和準(zhǔn)確度：取空白檢材（血液100μL、肝組織0.1 g）若干份，配制成質(zhì)量濃度為5.56、111.11和555.56 ng/mL（或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025、0.50和2.50 mg/g）的艾司西酞普蘭加標(biāo)樣品，各重復(fù)6次，按照本研究建立的方法進(jìn)行樣品前處理和檢測。另取若干份空白檢材（血液100μL、肝組織0.1g）按照本研究建立的方法進(jìn)行樣品前處理后分別添加艾司西酞普蘭儲(chǔ)備液，分別得到質(zhì)量濃度為5.56、111.11和555.56ng/mL（或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025、0.50和2.50 mg/g）的加標(biāo)樣品后進(jìn)樣，各重復(fù)6次。連續(xù)3d重復(fù)上述操作，分別得到日內(nèi)和日間精密度[以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示]。精密度和準(zhǔn)確度控制在15%以內(nèi)可視為良好。

提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)：取不同來源的生物樣品（血液100 μL、肝組織0.1 g）若干份，配制成質(zhì)量濃度為5.56和555.56 ng/mL（或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025和2.50mg/g）的艾司西酞普蘭加標(biāo)樣品，各重復(fù)6次，按照本研究建立的方法進(jìn)行樣品前處理和檢測。另取若干份不同來源的生物樣品（血液100μL、肝組織0.1g）按照本研究建立的方法進(jìn)行樣品前處理后分別添加艾司西酞普蘭儲(chǔ)備液，分別得到質(zhì)量濃度為5.56和555.56 ng/mL（或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025和2.50 mg/g）的加標(biāo)樣品后進(jìn)樣，各重復(fù)6次。提取回收率=不同來源的生物樣品提取前添加一定濃度的艾司西酞普蘭峰面積平均值/不同來源的生物樣品提取后添加對應(yīng)濃度的艾司西酞普蘭峰面積平均值；基質(zhì)效應(yīng)=不同來源的生物樣品基質(zhì)提取后添加一定濃度的艾司西酞普蘭峰面積平均值/配制對應(yīng)濃度的艾司西酞普蘭峰面積平均值。提取回收率應(yīng)高于50%，基質(zhì)效應(yīng)在85%～115%視為良好。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲輔助離子液體-分散液液微萃取條件篩選

2.1.1 萃取劑類型的篩選

分散液液微萃取的關(guān)鍵在于萃取劑的選擇，合適的萃取劑要滿足以下要求：（1）與水不互溶且密度比水大，這樣方便在離心管底部形成回收富集相；（2）對待測物有良好的溶解性，萃取回收率較高[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)考察了[C4MIM][PF6]、[C6MIM][PF6]和[C8MIM][PF6]3種離子液體對艾司西酞普蘭的萃取效率影響。結(jié)果表明，[C6MIM][PF6]與其他兩種萃取劑相比，萃取效果更優(yōu)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此，最終選擇[C6MIM][PF6]為本研究的萃取劑。

2.1.2 萃取劑體積的篩選

本研究考察了80、100和120 μL的離子液體體積。結(jié)果表明：萃取劑體積為100 μL時(shí)與其他兩種體積相比，萃取效率最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此，選擇萃取劑體積為100μL。

2.1.3 分散劑類型的篩選

分散劑既要與水和萃取劑互溶，又要與萃取劑和樣品混合形成乳濁液，分散劑的好壞直接影響萃取效率的高低。本研究選取甲醇、乙腈和丙酮作為分散劑。結(jié)果表明：在血液樣品中用乙腈作為分散劑與其他兩種分散劑相比，效果最佳，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在肝組織樣品中3種分散劑差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合考慮，選擇乙腈作為分散劑。

2.1.4 分散劑體積的篩選

分散劑的體積直接影響萃取劑與待測物形成的混濁體系，本研究選擇體積為220、250和270μL的乙腈進(jìn)行比較。結(jié)果表明：乙腈體積為250 μL時(shí)與其他兩種體積相比，血液和肝組織中目標(biāo)物響應(yīng)最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），故選擇分散劑乙腈的體積為250μL。

2.1.5 超聲時(shí)間的選擇

本研究考察了不同超聲時(shí)間（4、6、8、10和12min）對萃取效率的影響。一般來說，超聲時(shí)間越長，萃取劑與待測物接觸越充分，萃取效率越高。但是隨著超聲時(shí)間的延長，反應(yīng)體系溫度會(huì)上升，萃取效率反而有所降低。結(jié)果表明：在血液樣品中，超聲時(shí)間為4min時(shí)與其他4種超聲時(shí)間相比，效果最佳，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在肝組織樣品中，5種超聲時(shí)間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合考慮，選擇超聲時(shí)間為4min。

2.1.6 酸堿性條件的影響

本研究目標(biāo)物艾司西酞普蘭屬于弱堿性物質(zhì)，在弱堿性環(huán)境中更容易被有機(jī)溶劑提取，因此選擇pH值為9、10和11進(jìn)行考察。結(jié)果表明：反應(yīng)體系pH值為10時(shí)，血液和肝組織中艾司西酞普蘭響應(yīng)最高，且與其他兩種pH值相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此，選擇反應(yīng)體系pH值為10。

2.1.7 鹽含量的影響

通過向待測溶液中加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0、2%、4%、6%和8%）的氯化鈉溶液，考察鹽含量對萃取效率的影響。結(jié)果表明，鹽的加入量對萃取效果影響不大，所以本研究選擇不加鹽。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

選擇性：空白血液和肝組織的總離子流色譜圖（total ion chromatogram，TIC）見圖2，空白血液中添加艾司西酞普蘭的MRM色譜圖見圖3，空白肝組織中添加艾司西酞普蘭的MRM色譜圖見圖4。采用超聲輔助離子液體-分散液液微萃取-GC-MS/MS檢測艾司西酞普蘭的方法專屬性強(qiáng)、特異性好，血液和肝組織中內(nèi)源性物質(zhì)對艾司西酞普蘭的檢測沒有干擾。

線性、LOD和LOQ：血液樣品中艾司西酞普蘭在5.56～1 111.10 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）大于0.999；肝組織樣品中艾司西酞普蘭在0.025～5.00 mg/g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999。本方法的LOD和LOQ能夠滿足法醫(yī)毒物分析實(shí)際檢案的需要。詳見表1。

圖2 空白血液和空白肝組織的TICFig.2 TIC of blank blood and blank liver

圖3 空白血液中添加艾司西酞普蘭的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of blood spiked with escitalopram

圖4 空白肝組織中添加艾司西酞普蘭的MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatogram of liver spiked with escitalopram

表1 艾司西酞普蘭在血液和肝組織中的線性方程、LOD和LOQTab.1 Linear equation，LOD and LOQ of escitalopram in blood and liver

精密度及準(zhǔn)確度：血液樣品中艾司西酞普蘭的日內(nèi)精密度為12.66%～13.41%，日間精密度為14.01%～17.88%；肝組織樣品中艾司西酞普蘭的日內(nèi)精密度為0.81%～1.00%，日間精密度為0.97%～1.41%。血液和肝組織樣品的準(zhǔn)確度均低于15%。詳見表2～3。本研究中樣品的精密度及準(zhǔn)確度均符合方法學(xué)驗(yàn)證的要求。

提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)：血液和肝組織樣品中艾司西酞普蘭的提取回收率均大于50%，基質(zhì)效應(yīng)在86.55%～114.90%（表2～3）。

表2 艾司西酞普蘭在血液中的精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)Tab.2 Precision，accuracy，extraction recovery rates and matrix effects of escitalopram in blood （%）

表3 艾司西酞普蘭在肝組織中的精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)Tab.3 Precision，accuracy，extraction recovery rates and matrix effects of escitalopram in liver （%）

2.3 案例應(yīng)用

某年8月23日17：45，劉某（男，30歲）因“乏力、食欲缺乏7 h，意識(shí)障礙3 h”入住某醫(yī)院，一般情況差，神志模糊，既往有1年抑郁癥病史，于8月24日00：55經(jīng)搶救無效死亡。為查明劉某的死亡原因，于8月30日在某司法鑒定中心進(jìn)行尸體檢驗(yàn)及藥（毒）物檢驗(yàn)。藥（毒）物檢驗(yàn)結(jié)果顯示：從送檢的白色藥片中檢出艾司西酞普蘭成分；從送檢的劉某心血、肝組織中均檢出艾司西酞普蘭成分；用超聲輔助離子液體-分散液液微萃取-GC-MS/MS聯(lián)用法檢出劉某心血中艾司西酞普蘭質(zhì)量濃度為1.26μg/mL，肝組織中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.44mg/g。

3 結(jié) 論

離子液體作為一種新興化學(xué)試劑，因其蒸汽壓低、液態(tài)范圍寬、環(huán)境友好等優(yōu)勢在樣品前處理領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。本研究采用超聲輔助離子液體-分散液液微萃取-GC-MS/MS聯(lián)用法檢測生物樣品中艾司西酞普蘭，該方法較傳統(tǒng)液液萃取[13]、固相萃取[14]減少了有機(jī)溶劑的使用，降低了檢測成本，且操作簡單、快速，雜質(zhì)干擾少，富集效率高，可滿足生物檢材中艾司西酞普蘭的檢測要求，并且環(huán)境友好優(yōu)勢突出，不僅可作為一種改良方法在藥毒物定性定量分析中推廣使用，而且本研究建立的方法還可為艾司西酞普蘭相關(guān)案件提供技術(shù)支持。