(1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院,山西 太原 030001;2.公安部物證鑒定中心 現(xiàn)場物證溯源技術(shù)國家工程實驗室 法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點實驗室,北京 100038;3.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室,北京 102206;4.棗莊學(xué)院數(shù)學(xué)與統(tǒng)計學(xué)院,山東 棗莊 277160)
體液組織屬性來源鑒別即鑒別未知斑跡或體液屬于何種體液組織,進而推斷案發(fā)現(xiàn)場可能發(fā)生過的犯罪活動,可以為案發(fā)現(xiàn)場的重建提供線索,并為案件偵破提供有力的證據(jù)支持[1-2]。血液作為法醫(yī)學(xué)最常見的體液檢材,其準(zhǔn)確定性意義重大,而對確定為血液的樣本進一步鑒別其是外周血還是月經(jīng)血,可為案件定性提供重要的指向性線索。當(dāng)前,外周血與月經(jīng)血兩種法醫(yī)學(xué)常見體液的鑒別依然是法醫(yī)學(xué)體液組織來源鑒別的難點。
目前法醫(yī)學(xué)實踐中使用的傳統(tǒng)體液鑒別方法如化學(xué)試驗、光譜方法和顯微鏡檢查等,缺乏特異性及靈敏性,每次只能檢測一種體液。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,一些新型的體液鑒別方法有望取代傳統(tǒng)體液識別方法,如RNA分析、DNA甲基化以及微生物法等,其中RNA分析[包括信使RNA(mRNA)、微RNA(microRNA,miRNA)等]技術(shù)最為成熟,有望解決法醫(yī)學(xué)常見的幾種體液(精液、外周血、唾液、陰道分泌液及月經(jīng)血等)的鑒別分析問題[3]。
miRNA是真核生物中一類長度約為22個堿基的不編碼蛋白質(zhì)的單鏈微小RNA,通過對mRNA的降解和翻譯抑制,發(fā)揮其基因表達調(diào)控作用[4]。miRNA因具有穩(wěn)定性高、組織特異性好等特性成為國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)者進行體液組織來源推斷研究的熱點[5-22]。然而,利用miRNA進行法醫(yī)學(xué)外周血與月經(jīng)血體液鑒別的研究仍存在不少問題及難點。2014年,HANSON等[8]采用logistic回歸分析法建立了月經(jīng)血鑒別模型,可準(zhǔn)確地將月經(jīng)血從外周血、精液、唾液、陰道分泌液4種體液中鑒別出來,但是缺乏外周血的鑒別方案。2016年,SAUER等[6]通過構(gòu)建兩個判別函數(shù),分別實現(xiàn)了唾液與陰道分泌液、月經(jīng)血與外周血的鑒別,但未實現(xiàn)月經(jīng)血、外周血兩種血液類樣本與非血液類樣本的鑒別。相關(guān)研究[6,8-9]證實了數(shù)學(xué)模型法適用于基于miRNA的法醫(yī)學(xué)體液鑒別的研究,但所構(gòu)建的模型鑒別范圍小,均未形成完善的法醫(yī)學(xué)外周血和月經(jīng)血的體液鑒別方案,亟須補充研究。
本研究從大量已發(fā)表的研究成果[6-8,11-22]中篩選出 6種 miRNA(miR-451a、miR-144-3p、miR-144-5p、miR-214-3p、miR-203-3p和miR-205-5p),同時選用RNU6b作為內(nèi)參基因,使用熒光定量PCR技術(shù)檢測目標(biāo)miRNA在不同體液中的相對表達量,并根據(jù)表達量數(shù)據(jù)構(gòu)建可同時區(qū)分血液與非血液類樣本以及區(qū)分外周血與月經(jīng)血樣本的判別分析模型,為法醫(yī)學(xué)外周血和月經(jīng)血的鑒別提供可行方案。
樣本來源:采集來自中國北方地區(qū)年齡在25~35歲的250名無關(guān)志愿者個體的體液類樣本,包括外周血、月經(jīng)血、唾液、精液和陰道分泌液各50份。所有志愿者均已簽署知情同意書。
采集方法:采用靜脈穿刺將外周血收集于入乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)抗凝采血管內(nèi),利用無菌塑料管采集唾液(樣本收集前禁食1 h),利用無菌廣口塑料杯收集精液(志愿者于樣本收集前禁欲2 d),以上液體樣本收集后直接置于-80℃冰箱儲存?zhèn)溆谩T陆?jīng)血(月經(jīng)周期前4d)和陰道分泌液均通過收集衛(wèi)生棉條獲取,經(jīng)室溫晾干1d后置于-80℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>
根據(jù)已報道的多篇研究[6-8,11-22]挑選出6種miRNA(miR-451a、miR-144-3p、miR-144-5p、miR-214-3p、miR-203-3p和miR-205-5p)進行研究,其中miRNA-451a和miR-144-3p為外周血特異性標(biāo)記,miR-203-3p、miR-205-5p為唾液特異性標(biāo)記,miR-144-5p、miR-214-3p為月經(jīng)血特異性標(biāo)記,使用RNU6b作為內(nèi)參基因[7,14-15],各miRNA及內(nèi)參基因的信息見表1。
表1 各miRNA及內(nèi)參基因的信息Tab.1 Information of each miRNA and the internal reference gene
采用miRNeasy Mini試劑盒(德國Qiagen公司),按照操作說明書進行總RNA的提取。利用NanoDrop 2000c分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)進行總RNA濃度和純度的測定[18]。
本研究采用莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄法,選用M-MLV Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司)進行反轉(zhuǎn)錄[18]。單個反轉(zhuǎn)錄體系共20μL:100ng總RNA,1μL特異莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物,4μL 5×First-Strand Buffer(美國Invitrogen公司),2 μL 0.1 mol/L二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT,美國Invitrogen公司),0.5μL dNTP混合物(日本TaKaRa公司),1 μL反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(美國Invitrogen公司),0.2 μL Recombinant RNasin?RNase Inhibitor(美國Promega公司),加無核酸酶水(日本TaKaRa公司)至體系為20 μL。反轉(zhuǎn)錄程序:16℃ 30min,37℃ 30min,65℃ 5min,4℃保溫。設(shè)置反轉(zhuǎn)錄陰性對照(用無核酸酶水取代反轉(zhuǎn)錄酶)。
采用SYBR Green實時熒光定量PCR技術(shù),其反應(yīng)體系共10μL:Power SYBR? Green PCR Master Mix(2×)5μL,通用正向擴增引物(10μmol/L)0.25μL,特異性反向擴增引物(10μmol/L)0.25μL,無核酸酶水4 μL,cDNA產(chǎn)物0.5 μL。實時熒光定量PCR擴增程序:95℃ 10min;95℃ 15s,60℃ 1min,共40個循環(huán);95℃ 15 s;60℃ 1 min條件下進行熔解曲線分析。在QuantStudioTM7 Flex Real-Time PCR System(美國Applied Biosystems公司)上進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。采用HID Real-Time PCR Analysis Software v1.3 收集數(shù)據(jù)[18]。將Ct>35視作未檢測到[6,23]。每份樣本檢測3次,取平均值。設(shè)置qPCR陰性對照(用無核酸酶水替換樣本作為模板)。
計算每個miRNA的相對表達量(ΔCt=CtmiRNACtRNU6b)。RNU6b作為內(nèi)參基因用于數(shù)據(jù)歸一化。隨機選取200份樣本(每種體液各40份)的相對表達量作為訓(xùn)練集樣本用于數(shù)據(jù)分析,以6種miRNA的相對表達量為自變量(x)、3類體液類型(外周血、月經(jīng)血及非血液類體液)為因變量(y)構(gòu)建模型。其中:y指代體液類型,y1~y3分別為外周血、月經(jīng)血和非血液類體液;x指代特定 miRNA 的 ΔCt值,x1~x6分別對應(yīng)miR-451a、miR-144-3p、miR-144-5p、miR-214-3p、miR-203-3p、miR-205-5p。
另外選取50份樣本(每種體液10份)的相對表達量作為測試集對模型進行準(zhǔn)確性驗證。
采用SPSS 22.0軟件對訓(xùn)練集樣本數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗、差異性分析、Fisher判別分析模型的構(gòu)建以及模型的交叉驗證和自身驗證。對于服從正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,不服從正態(tài)分布或方差齊性的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗法(Kruskal-WallisH檢驗)進行差異性分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。
使用熒光定量PCR檢測6種miRNA在200份訓(xùn)練集樣本中的相對表達量,同時進行正態(tài)分布檢驗,結(jié)果顯示,6種miRNA均不服從正態(tài)分布(P<0.05)。
將所有樣本分為3類體液[外周血、月經(jīng)血及非血液類體液樣本(唾液、精液、陰道分泌液)],進行Kruskal-WallisH檢驗,結(jié)果顯示:miR-451a、miR-144-3p及miR-205-5p在3類體液樣本間的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);miR-144-5p在外周血與非血液類樣本、月經(jīng)血與非血液類樣本間的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),在外周血與月經(jīng)血間的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);miR-203-3p和miR-214-3p在外周血與月經(jīng)血、外周血與非血液類樣本間的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),在月經(jīng)血與非血液類樣本間的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。
表2 6種miRNA在3類體液中的表達Tab.2 Expression of 6 miRNAs in 3 kinds of body fluids (±s)
表2 6種miRNA在3類體液中的表達Tab.2 Expression of 6 miRNAs in 3 kinds of body fluids (±s)
注:1)與外周血中同種miRNA比較,P<0.05;2)與月經(jīng)血中同種miRNA比較,P<0.05。
樣本類型外周血月經(jīng)血非血液類體液n 40 40 120 miR-451a-9.44±1.16-5.27±2.241)5.50±2.201)2)miR-144-3p 3.16±2.09 7.30±2.661)11.25±2.211)2)miR-205-5p 14.77±1.33 3.06±2.421)0.37±2.381)2)miR-214-3p 10.87±1.19 4.32±2.091)5.26±2.251)miR-144-5p 2.27±1.41 3.94±2.29 13.53±2.051)2)miR-203-3p 14.45±1.58 2.11±2.481)0.92±3.741)
基于200份訓(xùn)練集樣本的6種miRNA的相對表達量構(gòu)建判別函數(shù),建立3個Fisher判別函數(shù),用于鑒別3類體液,方程如下:
鑒別未知樣本是何種體液,需使用熒光定量PCR技術(shù)檢測6種miRNA及內(nèi)參基因獲取目標(biāo)miRNA的ΔCt值,代入上述3個函數(shù)方程,y值最大的函數(shù)對應(yīng)的體液類型即為未知樣本的體液類型。
為檢測所建立判別分析模型的準(zhǔn)確性,SPSS軟件自動對所構(gòu)建的判別分析模型進行自身驗證和交叉驗證,另外采用測試集樣本進一步檢驗?zāi)P偷臏?zhǔn)確性。模型自身驗證準(zhǔn)確率達99.5%,交叉驗證準(zhǔn)確率達99.5%,測試集樣本鑒別體液類型的準(zhǔn)確率可達100%,說明模型準(zhǔn)確性良好,可以滿足實際需要,見圖1。
圖1 3類體液樣本的判別分析模型分類結(jié)果Fig.1 Classification results of discriminant analysis model for 3 kinds of body fluid samples
近年來,miRNA因具有穩(wěn)定性高、組織特異性好等生物學(xué)特性,被國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)者廣泛用于法醫(yī)學(xué)體液組織來源推斷的研究中,但作為細胞內(nèi)調(diào)節(jié)分子,參與基因表達的調(diào)控,其表達水平受內(nèi)外環(huán)境影響,具有個體差異[2],進行大量樣本檢測后,miRNA檢測數(shù)據(jù)總體常呈非正態(tài)分布。本研究所用Fisher判別分析方法的原理是利用已知分類的大量樣本數(shù)據(jù)構(gòu)建判別分析模型,以判別未知樣本的所屬類型,該方法區(qū)別于其他判別分析方法的特點是其對數(shù)據(jù)總體的分布不作任何要求,適用范圍更廣,對基于miRNA的體液組織來源鑒別方法的構(gòu)建具有獨特的優(yōu)勢。
由于miRNA在體液組織中含量相對較低,以及不同實驗室所采用的試劑及技術(shù)平臺等不同,導(dǎo)致不同實驗室的結(jié)果并不完全一致[7,19]。本實驗室前期研究[18]結(jié)果顯示,miRNA在不同體液中的表達并非完全特異,但表達量卻存在差異,同時分析了多種miRNA在不同體液中的表達量差異情況,有望實現(xiàn)不同體液樣本的區(qū)分。本研究將miR-451a、miR-144-3p、miR-144-5p、miR-214-3p、miR-203-3p和miR-205-5p這6種miRNA作為候選分子標(biāo)志物,獲取其在不同體液樣本中的表達量數(shù)據(jù)后,采用非參數(shù)檢驗,分析6種miRNA在外周血、月經(jīng)血及非血液類體液中的鑒別潛力,數(shù)據(jù)結(jié)果證實了6種miRNA具有鑒別特定體液的能力。miR-203-3p、miR-205-5p常被用作唾液特異性標(biāo)記,本研究發(fā)現(xiàn),這兩種標(biāo)記不僅在唾液中高表達,還在月經(jīng)血中高表達,可用于鑒別外周血及月經(jīng)血。為更好地發(fā)揮每種miRNA的鑒別能力,本研究采用判別分析法,同時分析6種miRNA在多種體液中的表達情況并建立判別分析模型,結(jié)果顯示miR-451a、miR-144-3p、miR-144-5p、miR-214-3p、miR-203-3p和miR-205-5p這6種miRNA聯(lián)合使用可達到準(zhǔn)確鑒別月經(jīng)血、外周血及非血液性樣本的效果。
大量相關(guān)研究[5-19]在進行體液miRNA篩選時,均選擇特定體液的特異性miRNA分子,以達到通過檢測特定miRNA的存在與否判定樣本體液類型的目的。然而實際上,絕大多數(shù)miRNA的特異性并不能滿足直接判定的要求,如miR-205-5p在多種體液中都能檢測到其表達[6,12]。本研究通過對大量miRNA表達量數(shù)據(jù)的獲得和分析,確立了聯(lián)合使用多個miRNA判別不同體液樣本的方法,不用考慮某種或某幾種miRNA在特定體液中的特異性問題,直接根據(jù)表達量數(shù)值和數(shù)學(xué)公式進行結(jié)果判定,可規(guī)避主觀誤差或錯誤,結(jié)果更為科學(xué)、準(zhǔn)確。但本研究的判別分析模型是基于單一體液來源樣本構(gòu)建的,暫未涉及混合樣本,此外,對于統(tǒng)計學(xué)方法而言,樣本數(shù)量是保證模型準(zhǔn)確性的重要前提,后期研究將進一步增加樣本數(shù)量并繼續(xù)篩選特異性標(biāo)志物,以進一步驗證和提高模型的準(zhǔn)確性。
本研究通過對5種法醫(yī)學(xué)現(xiàn)場常見的體液類型共200份樣本的6種miRNA進行相對定量檢測,建立了鑒別外周血、月經(jīng)血及非血液類體液3組樣本的Fisher判別分析模型。模型自身驗證及交叉驗證準(zhǔn)確率均達99.5%,未知樣本組織來源的識別準(zhǔn)確率達100%,具有高度的特異性、準(zhǔn)確性,為解決法醫(yī)學(xué)體液鑒別難點提供了可行的鑒別策略,有望應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)體液組織來源鑒別的實踐中。