基于microRNA表達量及判別分析的外周血與月經(jīng)血鑒別

（1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.公安部物證鑒定中心 現(xiàn)場物證溯源技術(shù)國家工程實驗室 法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點實驗室，北京 100038；3.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室，北京 102206；4.棗莊學(xué)院數(shù)學(xué)與統(tǒng)計學(xué)院，山東 棗莊 277160）

體液組織屬性來源鑒別即鑒別未知斑跡或體液屬于何種體液組織，進而推斷案發(fā)現(xiàn)場可能發(fā)生過的犯罪活動，可以為案發(fā)現(xiàn)場的重建提供線索，并為案件偵破提供有力的證據(jù)支持[1-2]。血液作為法醫(yī)學(xué)最常見的體液檢材，其準(zhǔn)確定性意義重大，而對確定為血液的樣本進一步鑒別其是外周血還是月經(jīng)血，可為案件定性提供重要的指向性線索。當(dāng)前，外周血與月經(jīng)血兩種法醫(yī)學(xué)常見體液的鑒別依然是法醫(yī)學(xué)體液組織來源鑒別的難點。

目前法醫(yī)學(xué)實踐中使用的傳統(tǒng)體液鑒別方法如化學(xué)試驗、光譜方法和顯微鏡檢查等，缺乏特異性及靈敏性，每次只能檢測一種體液。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些新型的體液鑒別方法有望取代傳統(tǒng)體液識別方法，如RNA分析、DNA甲基化以及微生物法等，其中RNA分析[包括信使RNA（mRNA）、微RNA（microRNA，miRNA）等]技術(shù)最為成熟，有望解決法醫(yī)學(xué)常見的幾種體液（精液、外周血、唾液、陰道分泌液及月經(jīng)血等）的鑒別分析問題[3]。

miRNA是真核生物中一類長度約為22個堿基的不編碼蛋白質(zhì)的單鏈微小RNA，通過對mRNA的降解和翻譯抑制，發(fā)揮其基因表達調(diào)控作用[4]。miRNA因具有穩(wěn)定性高、組織特異性好等特性成為國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)者進行體液組織來源推斷研究的熱點[5-22]。然而，利用miRNA進行法醫(yī)學(xué)外周血與月經(jīng)血體液鑒別的研究仍存在不少問題及難點。2014年，HANSON等[8]采用logistic回歸分析法建立了月經(jīng)血鑒別模型，可準(zhǔn)確地將月經(jīng)血從外周血、精液、唾液、陰道分泌液4種體液中鑒別出來，但是缺乏外周血的鑒別方案。2016年，SAUER等[6]通過構(gòu)建兩個判別函數(shù)，分別實現(xiàn)了唾液與陰道分泌液、月經(jīng)血與外周血的鑒別，但未實現(xiàn)月經(jīng)血、外周血兩種血液類樣本與非血液類樣本的鑒別。相關(guān)研究[6，8-9]證實了數(shù)學(xué)模型法適用于基于miRNA的法醫(yī)學(xué)體液鑒別的研究，但所構(gòu)建的模型鑒別范圍小，均未形成完善的法醫(yī)學(xué)外周血和月經(jīng)血的體液鑒別方案，亟須補充研究。

本研究從大量已發(fā)表的研究成果[6-8，11-22]中篩選出 6種 miRNA（miR-451a、miR-144-3p、miR-144-5p、miR-214-3p、miR-203-3p和miR-205-5p），同時選用RNU6b作為內(nèi)參基因，使用熒光定量PCR技術(shù)檢測目標(biāo)miRNA在不同體液中的相對表達量，并根據(jù)表達量數(shù)據(jù)構(gòu)建可同時區(qū)分血液與非血液類樣本以及區(qū)分外周血與月經(jīng)血樣本的判別分析模型，為法醫(yī)學(xué)外周血和月經(jīng)血的鑒別提供可行方案。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

樣本來源：采集來自中國北方地區(qū)年齡在25～35歲的250名無關(guān)志愿者個體的體液類樣本，包括外周血、月經(jīng)血、唾液、精液和陰道分泌液各50份。所有志愿者均已簽署知情同意書。

采集方法：采用靜脈穿刺將外周血收集于入乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝采血管內(nèi)，利用無菌塑料管采集唾液（樣本收集前禁食1 h），利用無菌廣口塑料杯收集精液（志愿者于樣本收集前禁欲2 d），以上液體樣本收集后直接置于-80℃冰箱儲存?zhèn)溆谩Ｔ陆?jīng)血（月經(jīng)周期前4d）和陰道分泌液均通過收集衛(wèi)生棉條獲取，經(jīng)室溫晾干1d后置于-80℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 候選miRNA分子標(biāo)記的選擇

根據(jù)已報道的多篇研究[6-8，11-22]挑選出6種miRNA（miR-451a、miR-144-3p、miR-144-5p、miR-214-3p、miR-203-3p和miR-205-5p）進行研究，其中miRNA-451a和miR-144-3p為外周血特異性標(biāo)記，miR-203-3p、miR-205-5p為唾液特異性標(biāo)記，miR-144-5p、miR-214-3p為月經(jīng)血特異性標(biāo)記，使用RNU6b作為內(nèi)參基因[7，14-15]，各miRNA及內(nèi)參基因的信息見表1。

表1 各miRNA及內(nèi)參基因的信息Tab.1 Information of each miRNA and the internal reference gene

1.3 RNA提取和定量

采用miRNeasy Mini試劑盒（德國Qiagen公司），按照操作說明書進行總RNA的提取。利用NanoDrop 2000c分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行總RNA濃度和純度的測定[18]。

1.4 cDNA合成

本研究采用莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄法，選用M-MLV Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Invitrogen公司）進行反轉(zhuǎn)錄[18]。單個反轉(zhuǎn)錄體系共20μL：100ng總RNA，1μL特異莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物，4μL 5×First-Strand Buffer（美國Invitrogen公司），2 μL 0.1 mol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT，美國Invitrogen公司），0.5μL dNTP混合物（日本TaKaRa公司），1 μL反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（美國Invitrogen公司），0.2 μL Recombinant RNasin?RNase Inhibitor（美國Promega公司），加無核酸酶水（日本TaKaRa公司）至體系為20 μL。反轉(zhuǎn)錄程序：16℃ 30min，37℃ 30min，65℃ 5min，4℃保溫。設(shè)置反轉(zhuǎn)錄陰性對照（用無核酸酶水取代反轉(zhuǎn)錄酶）。

1.5 實時熒光定量PCR

采用SYBR Green實時熒光定量PCR技術(shù)，其反應(yīng)體系共10μL：Power SYBR? Green PCR Master Mix（2×）5μL，通用正向擴增引物（10μmol/L）0.25μL，特異性反向擴增引物（10μmol/L）0.25μL，無核酸酶水4 μL，cDNA產(chǎn)物0.5 μL。實時熒光定量PCR擴增程序：95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min，共40個循環(huán)；95℃ 15 s；60℃ 1 min條件下進行熔解曲線分析。在QuantStudioTM7 Flex Real-Time PCR System（美國Applied Biosystems公司）上進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。采用HID Real-Time PCR Analysis Software v1.3 收集數(shù)據(jù)[18]。將Ct＞35視作未檢測到[6，23]。每份樣本檢測3次，取平均值。設(shè)置qPCR陰性對照（用無核酸酶水替換樣本作為模板）。

1.6 統(tǒng)計分析

計算每個miRNA的相對表達量（ΔCt=CtmiRNACtRNU6b）。RNU6b作為內(nèi)參基因用于數(shù)據(jù)歸一化。隨機選取200份樣本（每種體液各40份）的相對表達量作為訓(xùn)練集樣本用于數(shù)據(jù)分析，以6種miRNA的相對表達量為自變量（x）、3類體液類型（外周血、月經(jīng)血及非血液類體液）為因變量（y）構(gòu)建模型。其中：y指代體液類型，y1～y3分別為外周血、月經(jīng)血和非血液類體液；x指代特定 miRNA 的 ΔCt值，x1～x6分別對應(yīng)miR-451a、miR-144-3p、miR-144-5p、miR-214-3p、miR-203-3p、miR-205-5p。

另外選取50份樣本（每種體液10份）的相對表達量作為測試集對模型進行準(zhǔn)確性驗證。

采用SPSS 22.0軟件對訓(xùn)練集樣本數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗、差異性分析、Fisher判別分析模型的構(gòu)建以及模型的交叉驗證和自身驗證。對于服從正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，不服從正態(tài)分布或方差齊性的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗法（Kruskal-WallisH檢驗）進行差異性分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 6種miRNA在5種體液中的表達

使用熒光定量PCR檢測6種miRNA在200份訓(xùn)練集樣本中的相對表達量，同時進行正態(tài)分布檢驗，結(jié)果顯示，6種miRNA均不服從正態(tài)分布（P＜0.05）。

將所有樣本分為3類體液[外周血、月經(jīng)血及非血液類體液樣本（唾液、精液、陰道分泌液）]，進行Kruskal-WallisH檢驗，結(jié)果顯示：miR-451a、miR-144-3p及miR-205-5p在3類體液樣本間的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；miR-144-5p在外周血與非血液類樣本、月經(jīng)血與非血液類樣本間的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），在外周血與月經(jīng)血間的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；miR-203-3p和miR-214-3p在外周血與月經(jīng)血、外周血與非血液類樣本間的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），在月經(jīng)血與非血液類樣本間的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2 6種miRNA在3類體液中的表達Tab.2 Expression of 6 miRNAs in 3 kinds of body fluids （±s）

表2 6種miRNA在3類體液中的表達Tab.2 Expression of 6 miRNAs in 3 kinds of body fluids （±s）

注：1）與外周血中同種miRNA比較，P＜0.05；2）與月經(jīng)血中同種miRNA比較，P＜0.05。

樣本類型外周血月經(jīng)血非血液類體液n 40 40 120 miR-451a-9.44±1.16-5.27±2.241）5.50±2.201）2）miR-144-3p 3.16±2.09 7.30±2.661）11.25±2.211）2）miR-205-5p 14.77±1.33 3.06±2.421）0.37±2.381）2）miR-214-3p 10.87±1.19 4.32±2.091）5.26±2.251）miR-144-5p 2.27±1.41 3.94±2.29 13.53±2.051）2）miR-203-3p 14.45±1.58 2.11±2.481）0.92±3.741）

2.2 Fisher判別分析模型的建立

基于200份訓(xùn)練集樣本的6種miRNA的相對表達量構(gòu)建判別函數(shù)，建立3個Fisher判別函數(shù)，用于鑒別3類體液，方程如下：

鑒別未知樣本是何種體液，需使用熒光定量PCR技術(shù)檢測6種miRNA及內(nèi)參基因獲取目標(biāo)miRNA的ΔCt值，代入上述3個函數(shù)方程，y值最大的函數(shù)對應(yīng)的體液類型即為未知樣本的體液類型。

2.3 Fisher判別分析模型準(zhǔn)確性的驗證

為檢測所建立判別分析模型的準(zhǔn)確性，SPSS軟件自動對所構(gòu)建的判別分析模型進行自身驗證和交叉驗證，另外采用測試集樣本進一步檢驗?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性。模型自身驗證準(zhǔn)確率達99.5%，交叉驗證準(zhǔn)確率達99.5%，測試集樣本鑒別體液類型的準(zhǔn)確率可達100%，說明模型準(zhǔn)確性良好，可以滿足實際需要，見圖1。

圖1 3類體液樣本的判別分析模型分類結(jié)果Fig.1 Classification results of discriminant analysis model for 3 kinds of body fluid samples

3 討 論

近年來，miRNA因具有穩(wěn)定性高、組織特異性好等生物學(xué)特性，被國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)者廣泛用于法醫(yī)學(xué)體液組織來源推斷的研究中，但作為細胞內(nèi)調(diào)節(jié)分子，參與基因表達的調(diào)控，其表達水平受內(nèi)外環(huán)境影響，具有個體差異[2]，進行大量樣本檢測后，miRNA檢測數(shù)據(jù)總體常呈非正態(tài)分布。本研究所用Fisher判別分析方法的原理是利用已知分類的大量樣本數(shù)據(jù)構(gòu)建判別分析模型，以判別未知樣本的所屬類型，該方法區(qū)別于其他判別分析方法的特點是其對數(shù)據(jù)總體的分布不作任何要求，適用范圍更廣，對基于miRNA的體液組織來源鑒別方法的構(gòu)建具有獨特的優(yōu)勢。

由于miRNA在體液組織中含量相對較低，以及不同實驗室所采用的試劑及技術(shù)平臺等不同，導(dǎo)致不同實驗室的結(jié)果并不完全一致[7，19]。本實驗室前期研究[18]結(jié)果顯示，miRNA在不同體液中的表達并非完全特異，但表達量卻存在差異，同時分析了多種miRNA在不同體液中的表達量差異情況，有望實現(xiàn)不同體液樣本的區(qū)分。本研究將miR-451a、miR-144-3p、miR-144-5p、miR-214-3p、miR-203-3p和miR-205-5p這6種miRNA作為候選分子標(biāo)志物，獲取其在不同體液樣本中的表達量數(shù)據(jù)后，采用非參數(shù)檢驗，分析6種miRNA在外周血、月經(jīng)血及非血液類體液中的鑒別潛力，數(shù)據(jù)結(jié)果證實了6種miRNA具有鑒別特定體液的能力。miR-203-3p、miR-205-5p常被用作唾液特異性標(biāo)記，本研究發(fā)現(xiàn)，這兩種標(biāo)記不僅在唾液中高表達，還在月經(jīng)血中高表達，可用于鑒別外周血及月經(jīng)血。為更好地發(fā)揮每種miRNA的鑒別能力，本研究采用判別分析法，同時分析6種miRNA在多種體液中的表達情況并建立判別分析模型，結(jié)果顯示miR-451a、miR-144-3p、miR-144-5p、miR-214-3p、miR-203-3p和miR-205-5p這6種miRNA聯(lián)合使用可達到準(zhǔn)確鑒別月經(jīng)血、外周血及非血液性樣本的效果。

大量相關(guān)研究[5-19]在進行體液miRNA篩選時，均選擇特定體液的特異性miRNA分子，以達到通過檢測特定miRNA的存在與否判定樣本體液類型的目的。然而實際上，絕大多數(shù)miRNA的特異性并不能滿足直接判定的要求，如miR-205-5p在多種體液中都能檢測到其表達[6，12]。本研究通過對大量miRNA表達量數(shù)據(jù)的獲得和分析，確立了聯(lián)合使用多個miRNA判別不同體液樣本的方法，不用考慮某種或某幾種miRNA在特定體液中的特異性問題，直接根據(jù)表達量數(shù)值和數(shù)學(xué)公式進行結(jié)果判定，可規(guī)避主觀誤差或錯誤，結(jié)果更為科學(xué)、準(zhǔn)確。但本研究的判別分析模型是基于單一體液來源樣本構(gòu)建的，暫未涉及混合樣本，此外，對于統(tǒng)計學(xué)方法而言，樣本數(shù)量是保證模型準(zhǔn)確性的重要前提，后期研究將進一步增加樣本數(shù)量并繼續(xù)篩選特異性標(biāo)志物，以進一步驗證和提高模型的準(zhǔn)確性。

本研究通過對5種法醫(yī)學(xué)現(xiàn)場常見的體液類型共200份樣本的6種miRNA進行相對定量檢測，建立了鑒別外周血、月經(jīng)血及非血液類體液3組樣本的Fisher判別分析模型。模型自身驗證及交叉驗證準(zhǔn)確率均達99.5%，未知樣本組織來源的識別準(zhǔn)確率達100%，具有高度的特異性、準(zhǔn)確性，為解決法醫(yī)學(xué)體液鑒別難點提供了可行的鑒別策略，有望應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)體液組織來源鑒別的實踐中。