整合素β1在大鼠兩種腦損傷模型中的差異性表達(dá)

（皖南醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002）

顱腦損傷的致傷方式推斷是法醫(yī)病理學(xué)的重要任務(wù)之一，不同的致傷方式如直線加速運(yùn)動(dòng)與旋轉(zhuǎn)加速運(yùn)動(dòng)造成的損傷各具特征。目前對(duì)這些特征的檢驗(yàn)，仍以大體形態(tài)觀察與傳統(tǒng)組織病理學(xué)檢驗(yàn)為主。一些成熟的技術(shù)如免疫組織化學(xué)方法卻未得到廣泛應(yīng)用，致使較多信息不能及早發(fā)現(xiàn)甚至遺漏，對(duì)致傷方式的推斷產(chǎn)生不利影響。顱腦損傷過程中，機(jī)械力傳導(dǎo)途徑包括細(xì)胞外基質(zhì)-整合素-細(xì)胞骨架系統(tǒng)、膜離子通道、膜受體及信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)等，其中整合素是關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1-2]。本研究對(duì)直線加速與旋轉(zhuǎn)加速大鼠腦損傷模型腦組織內(nèi)整合素β1（integrin β1）的表達(dá)差異性進(jìn)行比較，初步探討利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)integrin β1在腦組織內(nèi)表達(dá)的特征推斷顱腦損傷致傷方式的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康SD大鼠120只，雌雄不限，體質(zhì)量（300±20）g，隨機(jī)分為直線加速損傷組、旋轉(zhuǎn)加速損傷組、假手術(shù)組及正常對(duì)照組，每組30只。損傷組按損傷發(fā)生經(jīng)過時(shí)間再分為傷后30min、3h、6h、12h、3d和7d組，假手術(shù)組與正常對(duì)照組也分別于上述相應(yīng)6個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審核通過，符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》要求。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

integrin β1抗體、SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒（英國Abcam公司），多聚賴氨酸防脫玻片（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（美國Millipore公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），RIPA裂解液（美國Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制作

大鼠直線加速腦損傷模型采用液壓沖擊法[3]。用2%戊巴比妥鈉溶液（40mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，使大鼠呈俯臥位，將頭部固定于腦立體定向儀（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）上，剪去頂部皮毛，碘附消毒，沿正中線切開頭皮，暴露顱骨，在距前囟后方5mm中線處開直徑5mm圓形骨窗，保持硬腦膜完整。將打擊管通過骨窗水平安置于硬腦膜外，并嚴(yán)密固定在顱骨上。將打擊管接到液壓沖擊顱腦損傷儀（北京思睿維科技有限公司）打擊口，保持打擊管內(nèi)為密閉空間。將擺錘按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)液壓壓力要求輕度打擊（1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，約100kPa），對(duì)大鼠顱腦造成沖擊損傷。

大鼠旋轉(zhuǎn)加速腦損傷模型采用單擺式打擊法[4]。同上述方法麻醉大鼠，剪去頂部皮毛，暴露顱骨，不開顱，打擊錘以120°初始角度下落，打擊大鼠枕外隆突。

假手術(shù)組同上述方法麻醉大鼠，剪去頂部皮毛，暴露顱骨，鉆孔至硬腦膜而不形成骨窗。

正常對(duì)照組不做任何處理。

將各組大鼠在設(shè)定的時(shí)間用頸椎脫臼法處死，迅速取出大鼠全腦，將額葉、丘腦、枕葉及腦干左右等分，一半用于常規(guī)石蠟包埋切片和integrin β1免疫組織化學(xué)染色，另一半用于Western印跡法檢測(cè)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色

免疫組織化學(xué)染色參照SABC試劑盒說明書進(jìn)行，步驟如下：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫滅活10min，復(fù)合消化液修復(fù)20min，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）室溫封閉20 min，一抗室溫孵育2 h，二抗室溫孵育30 min，SABC室溫孵育30min，DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。以細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色或棕褐色產(chǎn)物為陽性結(jié)果。以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）取代一抗作為空白對(duì)照。

1.2.3 Western印跡法檢測(cè)

冰上快速分離待檢腦組織，加入裂解液，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白質(zhì)定量后，聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF膜電轉(zhuǎn)印，封閉，加一抗integrin β1抗體，按1∶1 000稀釋，4℃孵育過夜，二抗（山羊抗兔）按1∶5 000稀釋，室溫孵育2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色。內(nèi)參 βactin抗體（1∶1000）同法進(jìn)行Western印跡法檢測(cè)。

1.2.4 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Motic Images Advanced 3.0圖像分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)integrin β1免疫陽性表達(dá)物。隨機(jī)選擇5個(gè)相鄰視野，400倍光鏡下計(jì)算陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，最終取5個(gè)視野的平均值，各組所獲得的數(shù)據(jù)用±s表示。采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差和q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 大體及HE染色結(jié)果

直線加速損傷組和旋轉(zhuǎn)加速損傷組大鼠損傷后大腦表面基本正常，未見挫傷出血灶。鏡下見傷后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)元腫脹、胞質(zhì)紅染加深，膠質(zhì)細(xì)胞腫脹、增生及噬神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象，細(xì)胞間質(zhì)水腫等征象。上述征象主要見于枕部腦組織內(nèi)。假手術(shù)組及正常對(duì)照組大鼠腦組織無明顯形態(tài)學(xué)改變。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

大鼠在腦損傷后30 min即可觀察到integrin β1陽性表達(dá)，枕部打擊部位腦組織尤為明顯，陽性產(chǎn)物呈黃褐色，位于膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞膜、微血管周圍，隨著損傷經(jīng)過時(shí)間的延長(zhǎng)也可見部分神經(jīng)元周邊膠質(zhì)細(xì)胞增生并呈陽性表達(dá)，同時(shí)伴有細(xì)胞間質(zhì)水腫、膠質(zhì)細(xì)胞腫脹等征象。integrin β1陽性表達(dá)與損傷發(fā)生經(jīng)過時(shí)間相關(guān)，損傷經(jīng)過時(shí)間越長(zhǎng)，表達(dá)越強(qiáng)，表現(xiàn)為染色加深、陽性細(xì)胞數(shù)增多及分布范圍擴(kuò)大，傷后6h達(dá)高峰并維持3d左右，隨后呈下降趨勢(shì)，1周內(nèi)仍有表達(dá)，呈現(xiàn)時(shí)序性變化規(guī)律。正常對(duì)照組及假手術(shù)組有少數(shù)部位膠質(zhì)細(xì)胞周邊、微血管壁integrin β1呈弱陽性表達(dá)。

大鼠腦損傷后腦組織中integrin β1陽性表達(dá)并非呈均勻分布，致傷方式不同其空間分布呈現(xiàn)不同特點(diǎn)。直線加速損傷組大鼠integrin β1在枕葉腦皮質(zhì)（直接打擊部位）、額葉腦皮質(zhì)等部位陽性表達(dá)較強(qiáng)，尤其是直接打擊部位表達(dá)最強(qiáng)，腦干部位表達(dá)則弱；旋轉(zhuǎn)加速損傷組大鼠integrin β1表達(dá)主要分布在枕葉腦皮質(zhì)（直接打擊部位）、丘腦、腦干等部位，也以直接打擊部位表達(dá)最強(qiáng)，額葉腦皮質(zhì)處表達(dá)較弱（圖1）。在同一時(shí)間窗口期，額葉處integrin β1陽性細(xì)胞數(shù)在直線加速損傷組明顯高于旋轉(zhuǎn)加速損傷組（P＜0.05），旋轉(zhuǎn)加速損傷組腦干處integrin β1陽性細(xì)胞數(shù)則高于直線加速損傷組（P＜0.05），而在枕部打擊點(diǎn)及丘腦部位integrin β1陽性表達(dá)差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

圖1 兩種腦損傷模型大鼠傷后6h腦組織內(nèi)integrin β1的表達(dá)（蘇木精復(fù)染，SABC×400）Fig.1 Expression of integrin β1 in two traumatic brain injury models of rats 6h after injury（Hematoxylin counterstaining，SABC×400）

表1 兩種腦損傷模型大鼠傷后不同時(shí)間點(diǎn)額葉、腦干、枕葉和丘腦中integrin β1的表達(dá)Tab.1 Expression of integrin β1 in the frontal lobe，brain stem，occipital lobe and thalamus of rats in two traumatic brain injury models at different time points after injury （n=30，±s）

表1 兩種腦損傷模型大鼠傷后不同時(shí)間點(diǎn)額葉、腦干、枕葉和丘腦中integrin β1的表達(dá)Tab.1 Expression of integrin β1 in the frontal lobe，brain stem，occipital lobe and thalamus of rats in two traumatic brain injury models at different time points after injury （n=30，±s）

注：各損傷組與假手術(shù)組、正常對(duì)照組及相鄰上組相同部位比較，P＜0.05；1）與直線加速損傷組相同部位比較，P＜0.05。

組別假手術(shù)正常對(duì)照傷后30min傷后3h傷后6h傷后12h傷后3d傷后7d額葉直線加速損傷組2.10±0.56 1.70±0.63 12.10±2.11 24.10±2.76 45.70±4.16 34.70±3.71 27.10±2.23 16.10±1.68旋轉(zhuǎn)加速損傷組1.80±0.74 1.20±0.46 4.60±1.041）7.20±1.441）14.60±2.471）11.60±2.111）9.60±1.121）7.60±1.341）腦干直線加速損傷組1.40±0.36 1.10±0.33 2.70±1.31 4.10±1.83 11.50±2.32 9.30±1.77 7.50±1.23 4.90±0.83旋轉(zhuǎn)加速損傷組1.20±0.51 0.80±0.46 8.40±1.471）13.40±2.231）27.40±3.111）19.40±2.511）15.40±2.121）11.40±1.721）枕葉直線加速損傷組3.60±0.96 2.20±0.61 22.70±3.17 58.60±5.11 167.20±13.43 139.80±11.28 111.40±8.03 69.70±6.82旋轉(zhuǎn)加速損傷組3.10±1.01 1.90±0.53 21.90±3.21 53.90±5.17 151.70±11.82 142.10±10.89 105.30±7.91 70.10±7.03丘腦直線加速損傷組1.60±0.61 1.40±0.46 5.40±1.17 11.40±2.03 27.40±3.41 17.90±2.61 15.80±2.42 10.40±1.82旋轉(zhuǎn)加速損傷組1.40±0.71 1.30±0.44 6.10±1.22 11.70±1.93 26.10±3.47 18.70±2.59 16.40±2.37 12.10±1.96

2.3 Western印跡法檢測(cè)結(jié)果

兩個(gè)損傷組大鼠腦組織內(nèi)integrin β1均于傷后30min開始增加，傷后6h達(dá)高峰，持續(xù)1周左右。直線加速損傷組與旋轉(zhuǎn)加速損傷組大鼠integrin β1陽性表達(dá)區(qū)域均以枕部為主。但在額葉處直線加速損傷組integrin β1陽性表達(dá)明顯強(qiáng)于旋轉(zhuǎn)加速損傷組，而在腦干處直線加速損傷組大鼠integrin β1陽性表達(dá)則較旋轉(zhuǎn)加速損傷組減弱（圖2）。假手術(shù)組與正常對(duì)照組大鼠腦組織內(nèi)僅檢測(cè)到少量integrin β1陽性表達(dá)。

圖2 兩種腦損傷模型大鼠傷后6h腦組織內(nèi)integrin β1的蛋白表達(dá)（Western印跡法）Fig.2 Protein expression of integrin β1 in two traumatic brain injury models of rats 6h after injury（Western blotting）

3 討 論

細(xì)胞力學(xué)研究結(jié)果表明，機(jī)械應(yīng)力傳入細(xì)胞存在傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。傳導(dǎo)是以機(jī)械波的形式傳入細(xì)胞，使細(xì)胞骨架進(jìn)行整體重排引起細(xì)胞形態(tài)改變，并通過與細(xì)胞膜上的分子直接聯(lián)系，將力在細(xì)胞內(nèi)傳遞分布，所發(fā)出的調(diào)節(jié)信息以力的形式傳遞[5]，再經(jīng)過效應(yīng)分子將力學(xué)信號(hào)最終表現(xiàn)在效應(yīng)點(diǎn)上[6]。當(dāng)力傳導(dǎo)到細(xì)胞的效應(yīng)部位時(shí)，力信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為生理和生化信號(hào)，引起細(xì)胞的生理和生化應(yīng)答。整合素是機(jī)械應(yīng)力傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵。作用在細(xì)胞表面的應(yīng)力通過整合素受體及時(shí)響應(yīng)傳遞到細(xì)胞內(nèi)各區(qū)，將響應(yīng)的機(jī)械力信號(hào)有選擇地轉(zhuǎn)換到細(xì)胞和核內(nèi)不同結(jié)構(gòu)部件上，實(shí)現(xiàn)力化學(xué)轉(zhuǎn)化[7]。

整合素在腦內(nèi)廣泛分布，存在潛伏型和激活型兩種構(gòu)型。在腦損傷后信號(hào)傳遞過程中，整合素胞外域與細(xì)胞外基質(zhì)作用，通過跨膜域連接胞內(nèi)域，胞內(nèi)域與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外之間的雙向信號(hào)傳遞[8-9]。integrin β1是中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種整合素的共同組成部分，在神經(jīng)細(xì)胞損傷后表達(dá)明顯上升[10]，誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[11]、成神經(jīng)干細(xì)胞[12]遷移至損傷腦組織處，對(duì)腦損傷進(jìn)行修復(fù)。本研究結(jié)果表明，腦損傷發(fā)生后integrin β1被快速激活，傷后30min即可檢測(cè)到陽性表達(dá)，于傷后6h達(dá)高峰，隨后呈下降趨勢(shì)，持續(xù)1周時(shí)，仍可檢見陽性表達(dá)。

本研究觀察到integrin β1陽性表達(dá)并非呈全腦反應(yīng)，在兩種腦損傷模型的大鼠腦組織中，均以枕部（打擊點(diǎn)處）integrin β1陽性表達(dá)最為顯著。直線加速損傷組大鼠額葉處integrin β1陽性表達(dá)明顯強(qiáng)于旋轉(zhuǎn)加速損傷組大鼠該部位的integrin β1陽性表達(dá)，而在腦干處旋轉(zhuǎn)加速損傷組integrin β1陽性表達(dá)則較直線加速損傷組明顯。這種空間分布的差異性與顱腦損傷的生物力學(xué)特征相符合，即顱腦受到壓縮力、伸張力或剪切力等不同性質(zhì)的機(jī)械暴力作用后形成的機(jī)械應(yīng)力不同，神經(jīng)細(xì)胞所產(chǎn)生的應(yīng)力響應(yīng)特征如響應(yīng)部位、響應(yīng)程度等也存在區(qū)別。直線加速運(yùn)動(dòng)對(duì)沖部位因負(fù)壓產(chǎn)生空化現(xiàn)象導(dǎo)致對(duì)沖部位腦組織損傷[13-15]，旋轉(zhuǎn)加速產(chǎn)生的壓力梯度可引起腦干內(nèi)的剪切變形及運(yùn)動(dòng)性損傷[16]。

本研究結(jié)果表明，不同的生物力學(xué)機(jī)制對(duì)integrin β1陽性表達(dá)部位的分布產(chǎn)生不同的影響，integrin β1陽性表達(dá)部位與顱腦損傷的致傷方式存在關(guān)聯(lián)性。根據(jù)integrin β1陽性表達(dá)部位的差異，運(yùn)用逆向工程原理，可以推斷顱腦損傷的致傷方式。而在大鼠兩種腦損傷模型中，integrin β1陽性表達(dá)均以暴力作用點(diǎn)處腦組織最為顯著，對(duì)暴力擊打部位的確定有實(shí)用價(jià)值。暴力作用點(diǎn)的確定及腦損傷致傷方式的推定有助于腦損傷過程重建。

神經(jīng)細(xì)胞對(duì)機(jī)械應(yīng)力響應(yīng)是一個(gè)連續(xù)的過程，在整合素介導(dǎo)下，經(jīng)多種信號(hào)通路[17-21]激活下游蛋白因子如即早基因（c-fos、c-jun）、神經(jīng)巢蛋白（nestin）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）等，檢測(cè)腦損傷后各種蛋白因子表達(dá)部位、表達(dá)程度、表達(dá)范圍等與暴力作用方式的關(guān)聯(lián)性，是開展法醫(yī)學(xué)顱腦損傷的細(xì)胞力學(xué)研究的有益補(bǔ)充。