云南不明原因猝死高發(fā)地區(qū)彝族人群心臟疾病相關(guān)基因變異

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南省地方病防治所，云南 大理 671000）

云南不明原因猝死（Yunnan sudden unexplained death，YNSUD）是指主要發(fā)生在云南一些偏遠山區(qū)和半山區(qū)的一種不明原因猝死[1]。研究[2-5]結(jié)果表明，該病具有以下特點：發(fā)病迅速，病情變化快，病死率高；流行時間在6～9月，7～8月為高發(fā)季節(jié)；發(fā)病人群多為農(nóng)民，以青壯年為主，女性高發(fā)；具有明顯的民族、村莊和家庭聚集性，其中以彝族、漢族和傈僳族發(fā)病率較高；經(jīng)尸體解剖、組織病理學(xué)檢驗等全面檢驗后仍不能明確死因。因缺乏有效的防治措施，該病已嚴(yán)重影響到病區(qū)的社會安定和生活、生產(chǎn)秩序，已成為目前云南省較為嚴(yán)重的地方性公共衛(wèi)生問題。

YNSUD存活者的臨床表現(xiàn)、心電圖改變，部分猝死者頭昏、心慌、暈厥等生前表現(xiàn)，以及部分猝死案例解剖所見心臟病理改變，均提示部分猝死病例可能與心臟疾病有關(guān)[6-8]。心臟疾病，尤其是心肌病和心臟離子通道疾病被認(rèn)為是引起不明原因心臟性猝死的首要原因，目前已發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種心臟疾病相關(guān)基因的單核苷酸變異（single nucleotide variant，SNV），并證明部分變異與不明原因心臟性猝死有關(guān)[9-10]。本研究利用MassARRAY質(zhì)譜系統(tǒng)對YNSUD高發(fā)地區(qū)彝族人群25個心臟疾病相關(guān)基因的52個SNV位點進行基因分型，以探討YNSUD的死亡原因是否與心臟疾病相關(guān)基因的SNV相關(guān)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇YNSUD高發(fā)地區(qū)（大理州鶴慶縣、楚雄州大姚縣、臨滄市鳳慶縣、麗江市寧蒗縣）多個自然村彝族村民205例作為病區(qū)組（男性79例，女性126例）；以鄰村（居住的自然環(huán)境相同）健康彝族村民197例作為對照組（男性91例，女性106例）。對象均來自健康體檢招募并簽署知情同意書，經(jīng)體檢并詢問病史認(rèn)定無重大疾病。本研究經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血基因組DNA的提取

采用DP318血液基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取基因組DNA，操作步驟按照產(chǎn)品說明書進行。

1.2.2 SNV位點的選擇

所有SNV位點的選擇參考本課題組前期全基因組測序、全外顯子測序的結(jié)果[11-12]及SNP數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp），共選出25個心臟疾病相關(guān)基因的52個SNV位點進行基因分型，所有候選SNV位點見表1。在候選SNV位點中剔除飛行時間質(zhì)譜檢出率低于90%以及在對照組中不符合Hardy-Weinberg平衡的位點，對余下SNV位點的等位基因頻率和基因型頻率進行統(tǒng)計分析。

表1 本研究中的52個候選SNV位點Tab.1 Fifty-two candidate SNVs in this study

續(xù)表1Continued tab.1

1.2.3 SNV的基因分型

本研究采用基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術(shù)進行基因分型。使用NanoDropTM2000分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）檢測光密度值，確認(rèn)DNA樣品質(zhì)量濃度≥25ng/μL，使用MassARRAY質(zhì)譜系統(tǒng)（美國Sequenom公司）對質(zhì)量檢驗合格的DNA樣本進行檢測。結(jié)合SNP數(shù)據(jù)庫并使用Assay Designer 3.1軟件（美國Sequenom公司）設(shè)計PCR反應(yīng)和單堿基擴展引物，交由生物公司合成。主要實驗步驟包括：（1）采用PCR法對含有SNV位點的DNA片段進行擴增；（2）蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）去磷酸化處理，去除體系中游離的脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）；（3）單堿基延伸反應(yīng)；（4）樹脂除鹽純化；（5）用MassARRAY? Nanodispenser（美國Sequenom公司）將檢測樣品從384孔板點樣到SpectroCHIP芯片上；（6）將載有樣品的芯片放入MassARRAY質(zhì)譜系統(tǒng)中進行檢測，通過MassARRAY Typer 4.0軟件分析和輸出分型結(jié)果，獲取SNP分型數(shù)據(jù)。

1.2.4 心電圖檢查

使用MAC1200十二導(dǎo)聯(lián)心電圖機（美國GE公司）對病區(qū)組所有個體進行靜息平臥位狀態(tài)下心電圖檢查。設(shè)置參數(shù)：走紙速度為25 mm/s，靈敏度為10mm/mV。所有心電圖檢測結(jié)果均經(jīng)兩位專科醫(yī)生分析診斷。

1.2.5 統(tǒng)計處理

使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗分析兩組間等位基因頻率和基因型頻率的差異，當(dāng)基因型頻率≤5時，采用Fisher精確檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。通過χ2檢驗判斷各SNV位點的基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。使用蛋白功能預(yù)測軟件PolyPhen-2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）和SIFT（http://provean.jcvi.org/index.php）對兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的變異位點進行致病性預(yù)測。

2 結(jié) 果

2.1 基因分型結(jié)果

52個 SNV 位點中，TTN（rs72648960）、SCN5A（rs192379242）在基因分型檢測中檢出率低于90%，PKP2（rs1046116）、SCN1B（rs72558026）、TRDN（rs28494009）、DMD（rs228406）的基因型頻率在對照組中不符合Hardy-Weinberg平衡（P＜0.05），故將上述6個SNV位點予以剔除。

本研究中，ARVC致病基因的錯義變異位點DSG2（rs2278792，c.2318G＞A，p.R773K）的等位基因頻率及基因型頻率在病區(qū)組和對照組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而且該變異在病區(qū)組的等位基因頻率及基因型頻率均高于對照組（表2）。R773K位于DSG2基因的第14號外顯子上，第773位精氨酸（R）變成賴氨酸（K）。病區(qū)組205例中，共140例（68.3%）攜帶R773K變異；對照組197例中，共114例（57.9%）攜帶R773K變異。PolyPhen-2和SIFT軟件對R773K變異的致病性預(yù)測分值分別為0.027和0.210，結(jié)果均為良性。

表2 DSG2（rs2278792）在病區(qū)組和對照組的等位基因頻率及基因型頻率分布Tab.2 Distribution of allele frequency and genotype frequency of DSG2（rs2278792）in inpatient group and control group

2.2 心電圖檢查結(jié)果

病區(qū)組205例均接受心電圖檢查，71例（34.6%）檢出心電圖異常，其中54例攜帶R773K變異。主要檢見的心電圖改變有順（逆）鐘向轉(zhuǎn)位、電軸左（右）偏、ST段和T波改變、竇性心動過緩（速）以及房室傳導(dǎo)阻滯等（表3）。典型心電圖改變見圖1。

表3 R773K變異攜帶者的心電圖異常情況Tab.3 Abnormal electrocardiogram of R773K variant carriers

圖1 R773K變異攜帶者的心電圖Fig.1 Electrocardiogram of R773K variant carriers

3 討 論

自1975年YNSUD被首次報道以來，全省已上報400余起猝死病例[1]。其中部分猝死被認(rèn)為與“小白菌”中毒有關(guān)，但大部分案例中的死者親屬均稱死者生前從未食用過任何“小白菌”，而且在許多發(fā)病率高的村莊，沒有任何“小白菌”可供食用[13]。另外，YNSUD在彝族人群中的發(fā)生率較高。因此我們提出，YNSUD可能是遺傳基礎(chǔ)與多種因素共同作用的結(jié)果。

研究[9]結(jié)果表明，心肌病與心臟離子通道疾病是引起心臟性猝死的首要病因。其中，心肌病與多種蛋白質(zhì)（肌小節(jié)和橋粒等）編碼基因的SNV有關(guān)，心臟離子通道疾病包括LQTS、BrS和CPVT等與編碼心臟離子通道和相關(guān)蛋白基因的SNV有關(guān)[10]。同時，許多心臟疾病相關(guān)基因的SNV與心臟疾病和猝死有關(guān)[14-16]。為了探究YNSUD在彝族人群中高發(fā)的原因，本研究對YNSUD高發(fā)地區(qū)彝族人群52個心肌病及心臟離子通道疾病的SNV位點進行了基因分型，檢測到ARVC致病基因的錯義變異位點DSG2（rs2278792，c.2318G＞A，p.R773K）的等位基因頻率和基因型頻率在病區(qū)組和對照組中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而且病區(qū)組的等位基因頻率及基因型頻率均高于對照組。但該變異在蛋白功能預(yù)測軟件PolyPhen-2和SIFT的預(yù)測分值分別為0.027和0.210，結(jié)果均為良性，尚不能認(rèn)定該位點具有致病性。

本研究在病區(qū)組中檢出大量順（逆）鐘向轉(zhuǎn)位、電軸偏轉(zhuǎn)、ST段和T波改變、房室傳導(dǎo)阻滯等心電圖異常，提示病區(qū)組人群存在的心電異?？赡苁荵NSUD的潛在危險因子。

因YNSUD聚集區(qū)地域跨度大、各自環(huán)境封閉、各村落與外界基因交流較少，導(dǎo)致即使存在基因變異，也可能不同個體或者不同村落的基因變異也不一致，難以得出一個具有統(tǒng)計學(xué)意義的基因變異作為共同的危險因素。這就需要對每一起案件進行二代測序分析，具體問題具體分析，才可能探明其原因。

本研究在YNSUD高發(fā)地區(qū)彝族人群中檢測到1個錯義變異位點，其等位基因頻率和基因型頻率均高于對照組。這是首次對YNSUD高發(fā)地區(qū)彝族人群進行基因檢測，共檢測了52個SNV位點，結(jié)合基因分型結(jié)果、心電圖檢測結(jié)果以及蛋白質(zhì)功能預(yù)測結(jié)果，尚未發(fā)現(xiàn)明確的可致病性突變，故彝族人群YNSUD的高發(fā)原因還有待進一步研究。

為了驗證檢測的SNV位點的潛在致病作用，需要在后續(xù)的研究中進行蛋白質(zhì)功能的測定。此外，還需要對猝死者及其親屬進行分子研究，以便更好地評估心臟疾病相關(guān)基因變異的流行情況，特別是在具有民族和家庭聚集性的YNSUD高發(fā)地區(qū)。盡管基因變異可能是YNSUD發(fā)生的因素，但尚不能解釋YNSUD的時間聚集性，因此，應(yīng)對基因變異與環(huán)境的相互作用進一步研究。