納濾法制備高純度雪蓮果低聚果糖及其結(jié)構(gòu)表征

曲曉萌, 楊 革, 張澤浩, 張 蘭

(1.山東省濟寧衛(wèi)生學(xué)校,山東 濟寧 272000; 2.曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 曲阜 273165;3.山東第一醫(yī)科大學(xué),山東 泰安 271000; 4.牡丹江醫(yī)學(xué)院,黑龍江 牡丹江 157011)

雪蓮果(Smallanthussonchifolius) 別名亞貢、菊薯，為菊科多年生草本植物[1-3]，原產(chǎn)于安第斯山脈，是一種緩解糖尿病、腸道功能紊亂等多種慢性疾病的藥食兩用植物。近年在我國引種成功，目前部分省份已大面積種植[4]。低聚果糖由于具有獨特的生理功能、優(yōu)良的理化性質(zhì)及良好的食品加工特性，在食品、保健品及醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[5-7]。低聚果糖的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法是以蔗糖或菊糖為底物，通過酶法生產(chǎn)[8-11]，其產(chǎn)率不高，副產(chǎn)物較多，反應(yīng)條件不易控制，生產(chǎn)成本較高。因此，尋找新的低聚果糖的提取原料具有重要的實踐意義。雪蓮果塊莖中的低聚果糖占干質(zhì)量的40%～60%，且聚合度較低(平均聚合度為4.8)，是提取低聚果糖的優(yōu)良原料[12]。

目前雪蓮果低聚果糖的提取分離通常采取水提的方法，得到的低聚果糖產(chǎn)品純度較低，一般為30%左右[4]，主要雜質(zhì)有色素、蛋白質(zhì)及相當數(shù)量的無機鹽小分子物質(zhì)、多糖以及聚合度較大的果寡糖[13]，為了獲得蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖必須經(jīng)過進一步分離提純。對低聚果糖提純有化學(xué)和物理兩類方法，化學(xué)法主要采用生物酶技術(shù)，此方法提純的產(chǎn)品純度僅有70%～80%[14]，操作復(fù)雜且成本高；物理法有高效液相色譜法和膜分離法，其中色譜法可制備90%以上的高純低聚糖產(chǎn)品，但該技術(shù)設(shè)備復(fù)雜，僅在日本有過報道。納濾是一種新型的膜分離技術(shù)，納濾的截留分子質(zhì)量介于反滲透與超濾之間，而且納濾操作所需壓力要比反滲透低得多，試驗證明納濾對蔗果低聚糖體系具有很好的分離提純效果?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)是生物活性物質(zhì)呈現(xiàn)活性的基礎(chǔ)，高分子的一級結(jié)構(gòu)是決定高分子基本性質(zhì)的主要因素，為活性多糖的結(jié)構(gòu)與效應(yīng)關(guān)系的研究及人工合成活性寡糖提供參考數(shù)據(jù)。本研究采用二級納濾技術(shù)對提取的雪蓮果低聚果糖進行分離純化，通過中心組合設(shè)計及響應(yīng)面分析，建立了納濾制備高純度低聚果糖的數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化分離純化工藝，并對分離得到的低聚果糖樣品進行含量測定和一級結(jié)構(gòu)分析，以期為低聚果糖的工業(yè)制備提供參考，并為雪蓮果的精深加工和雪蓮果低聚果糖的生物學(xué)活性的實踐應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

雪蓮果塊莖由貴州紅星發(fā)展都勻綠友有限責(zé)任公司提供，D-(+)-葡萄糖標準品、蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)、蔗果五糖(GF4)購自Sigma公司， 實驗用水為重蒸水，所用其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

納米膜分離系統(tǒng)購自上海朗極化工有限公司，膜組件從美國海德能公司購進，101型膜用于分離單糖與二糖，截留相對分子質(zhì)量≥342，膜面積為2.0 m2；304型膜用于分離多糖，截留相對分子質(zhì)量≥880，膜面積為2.0 m2。

Agilent 1100高壓液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；370FT 2IR傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Niclet公司；Bruker AVANCE- 600超導(dǎo)體超屏蔽傅里葉變換核磁共振波譜儀，瑞士Bruker公司；RID26A示差折光檢測器，日本島津公司。

1.2 雪蓮果低聚果糖樣品的制備

取雪蓮果塊莖洗凈去皮，迅速放入0.25%抗壞血酸水溶液中護色后高速破碎使之勻漿，去離子水為溶媒以3 ∶1(g ∶mL)的料液比、提取溫度為25 ℃、提取時間為60 min的條件采用熱水浸提法進行提取，過濾之后的濾渣進行第二次提取。合并提取液，4 000 r/min離心20 min保留上清液，經(jīng)D101、 D72、 D315樹脂層析柱，調(diào)整提取液pH值為3，除去色素、黃酮、蛋白等大分子物質(zhì)。得到的濾液經(jīng)冷凍干燥后制得雪蓮果低聚果糖樣品。

1.3 納濾膜性能的測定

本實驗的核心是膜組件的設(shè)計，考慮適用性、可操作性和經(jīng)濟性。適用性體現(xiàn)在膜的截留相對分子質(zhì)量和截留率的大小[15]，本研究采用101型與304型納濾膜二級串聯(lián)的方式，可以很好濾去相對分子質(zhì)量超過880的多糖等大分子物質(zhì)以及相對分子質(zhì)量低于342的單糖、無機鹽等物質(zhì)，從而得到相對分子質(zhì)量為342～880的雪蓮果低聚果糖。測純水透過系數(shù)的目的是為了利用非平衡模型來檢驗非平衡熱力學(xué)模型的實用性及準確性。本實驗以101型膜的純水系數(shù)來表征膜組件的穩(wěn)定性[16]。

純水系數(shù)計算公式：JV=LP△P=V/(S·t)。其中，JV為膜通量，mL/(min·m2)，即單位時間內(nèi)單位面積膜面上濾出滲透液的體積；V為滲透液透過量，mL；S為有效膜面積，m2；t為得到滲透液體積為V的相應(yīng)時間，min；LP為純水系數(shù)，△P為操作壓力差[17]。分別在操作壓力為0.19、 0.23、 0.25和0.27 MPa條件下測定膜通量，溫度20 ℃，每10 min取一次觀測值，歷時4 h。

1.4 操作因素對納濾膜分離性能的影響

1.4.1料液pH值 以pH值分別為1、2、4、6、7、9、11的雪蓮果低聚果糖提取液，溫度20 ℃，操作壓力為0.07 MPa，循環(huán)流量為8 mL/min，料液10 g/L，純化倍數(shù)4次，以鹽截留率為指標考察pH值對低聚果糖體系的影響。截留率=(1-Cb/Ce)×100%。其中，Cb為透過液鹽濃度，mol/L，Ce為原料液鹽濃度，mol/L，鹽濃度測定采用導(dǎo)電率法[18]。

1.4.2循環(huán)流量 調(diào)節(jié)循環(huán)流量分別為5、10、15和20 mL/min，操作壓力固定在0.15 MPa，溫度20 ℃，測定截留率，以透析液在100 mL處時的截留率為指標考察循環(huán)流量對膜分離性能的影響。

1.4.3料液濃度和操作壓力 調(diào)節(jié)低聚果糖溶液質(zhì)量濃度分別為1、5、10 g/L及相應(yīng)壓力下，在溫度20 ℃，循環(huán)流量8 mL/min,pH值2，純化倍數(shù)4次條件下考察料液濃度和操作壓力對膜分離性能的影響。

1.4.4純化倍數(shù) 實驗中料液原始體積為500 mL，在溫度20 ℃，操作壓力為0.1 MPa，循環(huán)流量為8 mL/min,料液10 g/L，pH值為2條件下預(yù)濃縮料液至原始體積的一半，測鹽截留率與低聚果糖濃度；加水至原始體積，納濾脫鹽至體積為原始體積一半處停止，測其操作時間和截留率；再加水至原始體積，納濾脫鹽，如此反復(fù)。

1.5 低聚果糖納濾純化的RSM實驗設(shè)計

以操作壓力(Х1)、pH值(Х2)、循環(huán)流量(Х3)和純化倍數(shù)(Х4)為因子，溶液中低聚果糖純度為響應(yīng)值。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定中心組合實驗設(shè)計的實驗方案，通過響應(yīng)面分析(RSA)方法進行數(shù)據(jù)的回歸分析及顯著性檢驗，以確定低聚果糖純化的最佳工藝條件。每個試驗點重復(fù)2次，結(jié)果取平均值。

1.6 雪蓮果低聚果糖一級結(jié)構(gòu)表征

1.6.1組分含量測定 雪蓮果低聚果糖組分含量測定方法如下：將10 g/L樣品溶液經(jīng)HPLC分離，根據(jù)峰型判斷樣品純度。經(jīng)二級納濾純化的雪蓮果低聚果糖樣品用蒸餾水溶解后，經(jīng)0.5 μm微孔膜過濾供HPLC分析用。低聚果糖測定采用HPLC法，色譜條件參照QB/T 2491—2000標準，以峰面積歸一化測定蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖的純度[19]。

1.6.2組分分子質(zhì)量的確定 將樣品用重蒸水溶解后，以0.2 μm膜過濾后導(dǎo)入質(zhì)譜離子源。質(zhì)譜四極桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃，加速電壓6 kV，電子能量70 eV，掃描范圍20～600 u，分辨率600 bp；以2 ℃/min 從150 ℃梯度升溫至195 ℃，持續(xù)10 min。

1.6.3組分結(jié)構(gòu)分析 取樣品210 mg(KBr壓片)，在500～4000 cm-1范圍內(nèi)進行紅外掃描。取50 mg樣品溶于0.5 mL D2O中，于323 K下測定1H NMR譜及13C NMR譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 納濾膜純水系數(shù)的測定

如圖1所示，納濾膜的膜通量隨壓力的上升而平穩(wěn)升高[20]，應(yīng)用線性歸元法(P<0.01)計算得：JV=0.238△P，線性關(guān)系成立，說明該膜組件穩(wěn)定性、清潔度很好。應(yīng)用公式計算得出20 ℃時納濾膜的純水透過系數(shù)為0.238 mL/(min·m2)。

圖1 壓力對膜通量的影響Fig.1 Influence of pressure on membrane flux

2.2 不同因素對納濾膜分離性能的影響

2.2.1料液pH值 圖2給出了料液不同pH值條件下鹽截留率與膜通量的關(guān)系。壓力相同時，在酸性條件(pH值1～2)下鹽截留率隨pH值增大而增大。堿性條件下截留率普遍比酸性條件下高[21]，隨著pH值增大在一定范圍內(nèi)上下波動，表明pH值直接影響糖的分離性能。因此，選擇在酸性條件下進行脫鹽脫糖實驗，可以有效降低單價鹽截留率，提高分離效率，強化脫鹽脫糖效果。

圖2 不同pH值下鹽截留率隨膜通量變化曲線Fig.2 Variation curve of salt rejection rate with membrane flux at different pH values

2.2.2循環(huán)流量 由圖3可知，鹽截留率和膜通量隨循環(huán)流量增大而增加。根據(jù)濃差極化模型理論，循環(huán)流量越高，即膜面切向流速越高，傳質(zhì)系數(shù)越大，相同操作壓差下濃差極化程度越小，膜通量將越高，本研究結(jié)果與此相一致。然而就脫鹽效果而言，應(yīng)在保證一定的膜通量下采用較低的循環(huán)流量，循環(huán)流量在5～10 mL/min之間較適合。

圖3 循環(huán)流量與鹽截留率和膜通量的關(guān)系Fig.3 Relationship of circulation flow rate and salt rejection rete as well as membrane flux

2.2.3料液濃度和壓力 圖4給出了不同質(zhì)量濃度的低聚果糖料液膜通量隨壓力變化曲線，相同壓力下膜通量隨溶液質(zhì)量濃度的增加而下降。圖5為不同質(zhì)量濃度料液截留率隨膜通量變化曲線，相同膜通量下截留率隨質(zhì)量濃度的增加而下降。這是由于隨著溶液質(zhì)量濃度的增加，膜面濃度也增加，膜面濃差極化程度增大，膜孔中的電勢亦隨之降低， 無機離子受到膜電荷的影響變小，導(dǎo)致截留率降低膜通量下降。所以，在分離體系中適當降低料液濃度使膜的通道變大，會使無機離子更容易通過。

圖4 不同濃度料液的膜通量隨壓力變化曲線Fig.4 Variation of membrane flux with pressure in different concentration solutions

圖5 低聚果糖溶液截留率隨膜通量變化曲線Fig.5 Oligofructose retention rate with the flux curve-Figure

2.2.4純化倍數(shù) 用非連續(xù)間歇恒容脫鹽實驗來測定料液的純化倍數(shù)。從純化倍數(shù)與料液濃度的關(guān)系圖(圖6)中可以看出，進行4次恒容透析是比較合適的。除第一階段外，各滲濾操作階段料液濃度均逐步增加，這是因為水不被截留而不斷地通過納濾膜，料液中的鹽分雖然也隨之部分透過膜，但納濾膜對鹽、糖有一定的截留，隨著滲濾的進行料液濃度會逐漸增加，隨著水加入次數(shù)的增多，料液濃度又呈下降趨勢。在每一個滲濾階段，料液中鹽濃度逐漸增大，溶液中的反離子濃度也隨之增加，并在靜電力的作用下中和了大量膜表面的電荷使其有效電荷密度降低，從而對同離子的排斥力減弱，導(dǎo)致鹽截留率降低；反之亦然，在每一次滲濾溶劑加入后，原料液中鹽濃度減小，溶液中的反離子濃度也隨之減小，膜表面的有效電荷密度增加，對同離子的排斥力增強，因此，實際操作中隨著純化倍數(shù)的增加，鹽截留率也隨之增大。

圖6 純化倍數(shù)與料液濃度(a)及截留率(b)關(guān)系圖Fig.6 Relationship of purification fold and feed concentration(a) as well as rejection rate(b)

2.3 納濾純化低聚果糖的RSM分析

以低聚果糖純度為響應(yīng)值(Y)，通過SAS 8.0軟件的RSREG程序?qū)υ囼灲Y(jié)果進行響應(yīng)面回歸分析[22]，響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。

表1 納濾純化低聚果糖的響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 Experimental design and results of response of surface analysis of FOS by nanofiltration

通過RSREG程序?qū)υ囼灲Y(jié)果進行響應(yīng)面回歸分析，各因素經(jīng)二次回歸擬合后求得響應(yīng)函數(shù)，即回歸方程：

Y=90.384 5+2.291 724X1+2.519 85X2-1.434 25X3+6.309 47X4+0.65X1X2+3.820 6X1X3-3.017 39X1X4+7.410 58X2X3+0.350 512X2X4-0.555 934X3X4-3.569 9X12-2.573 24X22-1.886 84X32-1.436 54X42

由回歸分析結(jié)果(見表2)可知，應(yīng)用上述回歸方程描述各因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系時,其因變量和全體自變量的線性關(guān)系顯著(R2=0.98)，表明該方程對實驗結(jié)果的擬合情況良好，可以用該回歸方程對實驗真實值進行分析和預(yù)測。另外，從回歸方程各項的方差分析結(jié)果可知，壓力(X1)、pH值(X2)和純化倍數(shù)(X4)對低聚果糖純度的差異極顯著(P<0.01)，循環(huán)流量的差異也達到顯著水平(P<0.01)。 影響順序為純化倍數(shù)>pH值>操作壓力>循環(huán)流量。

表2 納濾純化低聚果糖的響應(yīng)面回歸分析結(jié)果Table 2 Regression results of response of surface analysis of FOS by nonofiltration

由表2還可以看出，交互項X1X3、X1X4、X2X3以及所有二次項對低聚果糖純度影響顯著。pH值、純化倍數(shù)的影響大于循環(huán)流量與操作壓力的影響。

為進一步求得各因素的最優(yōu)條件，對回歸方程進行偏導(dǎo)求零，得出極值方程組，求解結(jié)果經(jīng)實際條件修正，得出低聚果糖的最優(yōu)分離純化條件為：操作壓力為0.15 MPa，循環(huán)流量5.3 mL/min，pH值為2.7，純化倍數(shù)為5。在此條件下得到低聚果糖純度理論值為94.75%。重復(fù)實驗3次，測得低聚果糖純度為95.2%、 94.7%和95.1%，與該條件下的理論預(yù)測值相差小于1%，采用RSM法優(yōu)化得到的分離純化工藝參數(shù)準確可靠，具有實用推廣價值。低聚果糖樣品經(jīng)冷凍干燥得到白色粉末。

2.4 雪蓮果低聚果糖結(jié)構(gòu)表征

2.4.1定量測定 圖7為分離純化后的雪蓮果低聚果糖樣品的HPLC圖譜，樣品保留時間105～107 min，3種糖的分離度較好[23]。

保留時間/min1.蔗果三糖kestose; 2.蔗果四糖nistose; 3.蔗果五糖sucrose圖7 雪蓮果低聚果糖HPLC圖Fig.7 HPLC diagram of yacon oligofructose

得到蔗果三糖(GF2)線性回歸方程y=152 570x-470 123，R=0.999 1，檢出限為0.214 g/L；蔗果四糖(GF3)線性回歸方程y=147 764x-912 8.90，R=0.998 6， 檢出限為0.20 g/L;蔗果五糖(GF4)：線性回歸方程y=126 035x-453 87，R=0.998 9， 檢出限為0.221 g/L。檢出雪蓮果低聚果糖樣品中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖的質(zhì)量分數(shù)分別為20.6%、51.4%、23.1%，可以看出，經(jīng)二次納濾純化的雪蓮果低聚果糖樣品中低聚果糖純度為95.1%。

2.4.2質(zhì)譜分析 雪蓮果低聚果糖的質(zhì)譜分析結(jié)果見圖8。結(jié)果顯示：樣品中含有相對分子質(zhì)量分別為180、342、504、666、828的5種組分，分別是單糖(葡萄糖和果糖)、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。

圖8 雪蓮果低聚果糖質(zhì)譜圖Fig.8 Mass diagram of yacon oligofructose

2.4.3IR分析 雪蓮果低聚果糖IR分析結(jié)果見圖9。雪蓮果低聚果糖在500～4000 cm-1范圍內(nèi)具有呋喃糖類物質(zhì)的特征吸收峰[24]，3402 cm-1處的強吸收峰是糖分子中羥基(—OH)的伸縮振動吸收，2930 cm-1處峰是糖分子中C—H鍵的伸縮振動吸收，1431 cm-1處峰是糖分子中C—H鍵的變角振動吸收，由此可初步判斷該物質(zhì)是糖類化合物。1638 cm-1處的峰是糖分子中羰基(CO)的伸縮振動吸收；929 cm-1處的峰是呋喃糖環(huán)的對稱伸縮振動吸收，1031 cm-1處的峰是糖分子中C—O鍵的變角振動，619 cm-1處的峰是糖分子中β型的C—H直立鍵的變角振動吸收；紅外光譜分析結(jié)果表明：雪蓮果低聚果糖主要是由β-呋喃構(gòu)型的果糖組成的。

圖9 雪蓮果低聚果糖IR圖Fig.9 IR diagram of yacon oligofructose

2.4.41H NMR及13C NMR 分析 雪蓮果低聚果糖的氫譜、碳譜分析結(jié)果見圖10。

圖10 雪蓮果低聚果糖的1H NMR(a)和13C NMR(b)Fig.10 1H NMR(a) and 13C NMR(b) of yacon oligofructose

由圖可以初步推斷出雪蓮果低聚果糖的氫譜和碳譜特征。1H NMR的特點是葡萄糖端基質(zhì)子的1-H位于低場區(qū)，2-H和4-H 位于高場區(qū)，呈現(xiàn)特征的裂分信號[25]，其余信號都在兩組信號之間。δ4.2～4.5區(qū)域是果糖端基質(zhì)子的3-H 和4-H的信號區(qū)，這一部分的峰面積積分值(4.637)與葡萄糖端基質(zhì)子的5-H 信號區(qū)的峰面積積分值(1.000)的比值約為5 ∶1，因此可以初步判斷該化合物上果糖片段的聚合度為5，即該化合物平均包含5個果糖單元。13C NMR的特點是果糖端基的C-2季碳信號在最低場，果糖和葡萄糖殘基上的亞甲基(—CH2)碳信號在高場，而次甲基(—CH)碳信號均在δ103.17和δ63.03兩組碳信號之間。

3 結(jié) 論

3.1選擇操作壓力、循環(huán)流速、pH值、純化倍數(shù)4個因素，在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過中心組合設(shè)計及響應(yīng)面分析，建立了納濾分離純化制備高純度低聚果糖的二次多項數(shù)學(xué)模型，該模型對實驗真實值進行了很好地分析和預(yù)測。經(jīng)優(yōu)化的的工藝條件為：操作壓力0.15 MPa，循環(huán)流量5.3 mL/min，pH值為2.7，純化倍數(shù)為5，實際低聚果糖純度為95.1%，采用RSM法優(yōu)化得到的納濾分離純化工藝參數(shù)準確可靠，具有實用價值。

3.2通過HPLC-MS、IR、1H NMR及13C NMR等對雪蓮果低聚果糖組分的純度、組成、結(jié)構(gòu)進行表征，結(jié)果表明：經(jīng)納濾技術(shù)分離純化得到的雪蓮果低聚果糖由蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖組成，其質(zhì)量分數(shù)為95.1%，平均包含5個果糖單元，主要是由β-呋喃構(gòu)型的果糖組成。