脫氫樅基含氮衍生物的抑菌活性研究

翟兆蘭， 呂 仆， 趙 平， 宋湛謙， 商士斌， 饒小平,3*

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室；國(guó)家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京210042； 2.西南林業(yè)大學(xué) 西南地區(qū)林業(yè)生物質(zhì)資源高效利用國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224； 3.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)新技術(shù)研究所，北京 100091)

木材作為一種可再生生物質(zhì)材料，具有無(wú)毒、無(wú)污染、美觀、易加工等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于建筑和裝修等領(lǐng)域。但是木材含有豐富的纖維素，在合適的溫度和濕度下為木材腐朽菌和霉菌的生長(zhǎng)提供了養(yǎng)分，導(dǎo)致其很容易受蟲(chóng)菌侵蝕而腐朽，進(jìn)而使得木材的使用壽命縮短，造成木材經(jīng)濟(jì)價(jià)值和使用價(jià)值的嚴(yán)重?fù)p失[1-3]。因此，木材防腐、防霉技術(shù)的研究和開(kāi)發(fā)一直被廣泛關(guān)注。目前，雖然防腐效果好的防腐劑種類較多，但通常具有較大的毒性，會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和安全問(wèn)題，限制了其應(yīng)用領(lǐng)域。天然木材防腐劑具有毒性小、污染少、分散均勻、不易流失、可循環(huán)利用和防腐抗菌性能良好等優(yōu)點(diǎn)，因此，天然木材防腐劑研究對(duì)提高木材制品的安全性、環(huán)保性具有重要意義[4]。

植物次生代謝產(chǎn)物是由植物體內(nèi)有機(jī)化合物的初生代謝途徑衍生而來(lái)，是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化中與環(huán)境相互作用的結(jié)果[5]，分為萜類、酚類、含氮化合物、炔類和有機(jī)酸類等，可用作殺菌劑、殺蟲(chóng)劑、抗癌活性成分，對(duì)環(huán)境和人畜均無(wú)害，是一類理想的生物活性產(chǎn)品[6-8]。松香是由松樹(shù)樹(shù)脂道分泌的松脂經(jīng)蒸餾得到的二萜類植物次生代謝產(chǎn)物，產(chǎn)量豐富。松香的主要成分樹(shù)脂酸含有獨(dú)特的三環(huán)二萜氫化菲環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)使得松香具有多個(gè)手性中心和良好的生物活性[9-10]。并且松香樹(shù)脂酸含有雙鍵和羧基2種官能團(tuán)，易于進(jìn)行化學(xué)改性，可制備多種不同生物活性的松香衍生物[11-12]。Li等[13]以松香、丙烯酸和二乙烯三胺為原料合成松香基酰胺，當(dāng)其質(zhì)量濃度為64 g/L時(shí)，即可對(duì)彩絨革蓋菌實(shí)現(xiàn)Ⅰ級(jí)防腐(木材質(zhì)量損失率<10%)；質(zhì)量濃度為32 g/L時(shí)，對(duì)密粘褶菌實(shí)現(xiàn)Ⅰ級(jí)防腐。Chen等[14]以松香、富馬酸、環(huán)氧氯丙烷和三乙胺為原料合成松香季銨鹽化合物，其對(duì)變色栓菌、白腐真菌和白茅內(nèi)生菌均有良好的抑菌效果。Lin等[15]合成的馬來(lái)松香基二硫脲化合物，對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的最高抑制率為66.9%。Chen等[16]以脫氫樅酸為原料合成了16種新型噻唑烷酮類化合物，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.05 g/L時(shí)，部分化合物對(duì)玉米赤霉菌的抑制率達(dá)91.3%，表現(xiàn)出顯著的抑菌活性，與商業(yè)抑菌藥物嘧菌酯效果相當(dāng)。不同類型的松香衍生物對(duì)木材腐朽真菌及植物病原真菌均表現(xiàn)出較好的抑菌活性，但大多研究報(bào)道停留在衍生物的抑菌性能篩選，對(duì)結(jié)構(gòu)與性能的關(guān)系分析較少。本研究探討了松香改性產(chǎn)物脫氫樅酸、脫氫樅胺、脫氫樅酸酰胺衍生物和脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物對(duì)6種會(huì)引起霉變或腐變的不同植物病原真菌的抑菌活性，探索化合物結(jié)構(gòu)的改變對(duì)抑菌性能的影響，進(jìn)一步研究了時(shí)間和質(zhì)量濃度對(duì)抑菌活性的影響，以期篩選出抑菌活性高的松香衍生物。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

脫氫樅酸(1)、脫氫樅胺(2)、脫氫樅酸酰胺衍生物(3a～3m)和脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物(4a～4i)，自制，根據(jù)文獻(xiàn)[17]的方法合成及提純，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。灰葡萄孢(Botrytiscinerea) CGMCC 3.3790、腐皮鐮孢(Fusariumsolani) CGMCC 3.2889、禾谷鐮孢 (Fusariumgraminearum) CGMCC 3.4733、尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum) CGMCC 3.3633、蕓苔鏈格孢(Alternariabrassicae) CGMCC 3.7805和采絨革蓋菌 (Coriolusversicolor) CFCC 5336這6種供試植物病原真菌由中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心和中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。無(wú)水乙醇、葡萄糖、瓊脂和放線菌酮，均為分析純；蒸餾水、75%消毒酒精和95%酒精，實(shí)驗(yàn)室自制。

圖1 脫氫樅酸和脫氫樅基含氮衍生物的分子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Molecular structure of dehydroabietic acid and dehydroabietyl nitrogen derivatives

SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HVE-50高壓滅菌鍋，華粵行儀器有限公司； LG-520(D)醫(yī)藥專用柜，浙江華美電器制造有限公司；PQX-380D多段可編程人工氣候箱，寧波東南儀器有限公司。

1.2 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基的制備

準(zhǔn)確稱取馬鈴薯200 g，洗凈削皮，切成小塊。電磁爐將蒸餾水加熱至100 ℃，加入準(zhǔn)備好的馬鈴薯并不斷攪拌，防止粘鍋，待馬鈴薯煮至用水輕壓易碎，濾除馬鈴薯殘?jiān)?。將鍋洗凈，將馬鈴薯濾液倒入鍋中，并用小火加熱至沸騰，緩慢加入20 g葡萄糖，攪拌至葡萄糖完全溶解，再緩慢加入18 g瓊脂，快速攪拌，防止粘鍋，減小火力，待液體澄清透明，關(guān)火，冷卻至室溫，即得馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。將制備好的PDA培養(yǎng)基倒入量杯中，最終倒入備好的錐形瓶中，密封瓶口。

1.3 病原真菌活化

將洗凈的培養(yǎng)皿、接種針和PDA培養(yǎng)基放入高壓滅菌鍋中，0.1 MPa、121 ℃條件下滅菌22 min，將滅菌后的培養(yǎng)基及器具放入超凈工作臺(tái)，紫外燈照射15 min，關(guān)閉紫外燈，吹風(fēng)10 min；將未凝固的培養(yǎng)基傾倒至空皿，每皿倒入約20 mL，放平，待完全冷凝。用接種針將保存于試管中的病原真菌菌絲挑出，采用劃線法將菌絲接種于上述培養(yǎng)基平板上，不要?jiǎng)澠骗傊臃N完成后用封口膜將皿口密封以防止外部污染進(jìn)入；標(biāo)記接種菌的名稱和日期，將接種完畢的真菌平板放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，避光培養(yǎng)至有明顯菌落。

1.4 抑菌活性測(cè)定

1.4.1初步測(cè)定 采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定樣品溶液對(duì)病原真菌的抑制活性。準(zhǔn)確稱取36 mg樣品，用無(wú)水乙醇定容至10 mL，配制質(zhì)量濃度為3.6 g/L的待測(cè)樣液。在超凈工作臺(tái)中，用滅菌槍頭移取9 mL待測(cè)樣液，用0.22 μm無(wú)菌濾頭過(guò)濾后與171 mL、40 ℃的PDA培養(yǎng)基輕搖混和均勻。每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入含樣品的PDA培養(yǎng)基10 mL，設(shè)置每個(gè)培養(yǎng)皿中樣品的最終質(zhì)量濃度為180 mg/L，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使培養(yǎng)基均勻平鋪，標(biāo)記，冷卻凝固備用。

以無(wú)水乙醇為溶劑對(duì)照，以與待測(cè)液相同質(zhì)量濃度的放線菌酮水溶液為陽(yáng)性對(duì)照，以純PDA培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。溶劑對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照同上操作。

接種已活化好的病原真菌，所有病原真菌在同一天內(nèi)接種完畢。接種完畢放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～10 d，培養(yǎng)至第2、 4、 6、 8、 10 d時(shí)，用十字交叉法測(cè)量病原真菌的菌落生長(zhǎng)直徑，并記錄數(shù)據(jù)，抑制率計(jì)算公式如下：

式中：I—抑制率，%；D0—空白對(duì)照組平均直徑，mm；Ds—處理組平均直徑，mm。

1.4.2活性較好樣品的進(jìn)一步測(cè)定 根據(jù)初步測(cè)定的結(jié)果，對(duì)活性較好的樣品進(jìn)行進(jìn)一步抑菌活性測(cè)定。采用二倍稀釋法制備樣品的最終質(zhì)量濃度分別為90、 45、 22.5、 11.25 mg/L，同樣以無(wú)水乙醇為溶劑對(duì)照，以與待測(cè)液相同質(zhì)量濃度的放線菌酮水溶液為陽(yáng)性對(duì)照，以純PDA培養(yǎng)基為空白對(duì)照。同一個(gè)樣品在一個(gè)質(zhì)量濃度梯度下分別接種灰葡萄孢、采絨革蓋菌、腐皮鐮孢、尖孢鐮孢、蕓苔鏈格孢、禾谷鐮孢6種病原真菌，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)組，在28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，期間測(cè)量每種菌的生長(zhǎng)直徑，計(jì)算平均直徑和抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型脫氫樅基含氮衍生物的抑菌活性

2.1.1初步測(cè)定結(jié)果 化合物1、2、3a～3m和4a～4i對(duì)不同病原真菌的抑制活性如表1所示。

由表1可知，脫氫樅酸(1)僅對(duì)蕓苔鏈格孢的抑制率大于60%，對(duì)灰葡萄孢的抑制率大于40%，而對(duì)其他4種病原真菌的抑制率均小于40%。脫氫樅胺(2)對(duì)灰葡萄孢、腐皮鐮孢、蕓苔鏈格孢、禾谷鐮孢和尖孢鐮孢的抑制率均大于65%，并且脫氫樅胺對(duì)6種病原真菌的抑制率均大于脫氫樅酸，表明脫氫樅胺具有較好的抑菌活性，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于脫氫樅酸。脫氫樅酸酰胺衍生物(3a～3m)對(duì)6種病原真菌的抑制率均較低，僅脫氫樅酸酰胺(3a)對(duì)蕓苔鏈格孢的抑制率大于80%，3j對(duì)灰葡萄孢的抑制率大于90%。說(shuō)明脫氫樅酸酰胺衍生物對(duì)6種病原真菌的抑制活性較低。脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物(4a～4i)中的每個(gè)樣品至少對(duì)2種病原真菌的抑制率能達(dá)70%以上，并且其中4d對(duì)灰葡萄孢和蕓苔鏈格孢的抑制率為100%，4h對(duì)灰葡萄孢、腐皮鐮孢和蕓苔鏈格孢的抑制率為100%，與陽(yáng)性對(duì)照放線菌酮的抑制活性相當(dāng)。上述結(jié)果表明脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物對(duì)6種病原真菌具有較好的抑菌活性，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于脫氫樅酸酰胺衍生物。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用抑菌活性較好的4a～4i對(duì)6種不同病原真菌的抑制活性進(jìn)一步分析。

表1 脫氫樅酸和脫氫樅基含氮衍生物的抑菌活性(培養(yǎng)2天)Table 1 Antibacterial activities of dehydroabietic acid and dehydroabietyl nitrogen derivatives (cultivated 2 d)

2.1.2化合物4a～4i的抑菌活性 化合物4a對(duì)灰葡萄孢的抑制率大于90%，對(duì)禾谷鐮孢和尖孢鐮孢的抑制率大于80%，但對(duì)采絨革蓋菌的抑制率較差，小于20%。對(duì)比化合物4a，在苯環(huán)的對(duì)位引入甲氧基、氟原子和氯原子的4b、4g和4h對(duì)灰葡萄孢、腐皮鐮孢、蕓苔鏈格孢、禾谷鐮孢和尖孢鐮孢(4g除外)的抑制率均大于80%，具有突出的抑菌活性。此外，化合物4b、4g和4h對(duì)采絨革蓋菌的抑制率對(duì)比化合物4a均有較大的提高，表明在苯環(huán)的對(duì)位引入甲氧基、氟原子和氯原子增加了脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物的抑菌活性。對(duì)比化合物4g，化合物4f對(duì)灰葡萄孢和禾谷鐮孢同樣有較好的抑制活性，抑制率大于90%，但對(duì)腐皮鐮孢、蕓苔鏈格孢和尖孢鐮孢的抑制活性較差，表明脫氫樅胺(對(duì)氟)苯甲醛Schiff堿的抑菌活性比脫氫樅胺(間氟)苯甲醛Schiff堿的好。脫氫樅胺水楊醛Schiff堿(4c)對(duì)灰葡萄孢和蕓苔鏈格孢的抑制率大于90%，脫氫樅胺(對(duì)氯)水楊醛Schiff堿(4d)對(duì)灰葡萄孢和蕓苔鏈格孢的抑制率均為100%，與放線菌酮對(duì)灰葡萄孢和蕓苔鏈格孢的抑制活性相當(dāng)，同樣表明氯原子的引入增加了脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物的抑菌活性。此外，化合物4d對(duì)采絨革蓋菌具有較好的抑制活性，抑制率均大于80%。綜上所述，脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物苯環(huán)的對(duì)位被氯原子取代的化合物4d和4h對(duì)6種病原真菌抑制活性最好，對(duì)位被氟原子和甲氧基取代的化合物4g和4b次之，在間位被氟原子取代的化合物4f的抑菌效果也較好，說(shuō)明含有鹵素原子取代的脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物對(duì)6種病原真菌具有突出的抑制活性。

2.2 時(shí)間對(duì)脫氫樅基含氮衍生物抑菌活性的影響

選取對(duì)6種病原真菌具有較好抑制活性的含鹵素的脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物，脫氫樅胺(對(duì)氯)水楊醛Schiff堿(4d)、脫氫樅胺(間氟)苯甲醛Schiff堿(4f)、脫氫樅胺(對(duì)氟)苯甲醛Schiff堿(4g)和脫氫樅胺(對(duì)氯)苯甲醛Schiff堿(4h)，測(cè)定了其質(zhì)量濃度為180 mg/L時(shí)在不同時(shí)間下對(duì)6種病原真菌的抑制活性，結(jié)果如圖2所示。

a.4d； b.4f； c.4g; d.4h圖2 脫氫樅基含氮衍生物在不同時(shí)間下的抑菌活性Fig.2 Inhibitory activity of dehydroabietyl nitrogen derivatives at different time

化合物4d對(duì)灰葡萄孢和蕓苔鏈格孢在不同時(shí)間內(nèi)均具有突出的抑制活性，抑制率為100%，對(duì)腐皮鐮孢、禾谷鐮孢和尖孢鐮孢的抑制活性隨時(shí)間的增加而降低，2天時(shí)的抑制活性最高，對(duì)采絨革蓋菌的抑制活性隨時(shí)間的增加先升高后降低，第4天時(shí)的抑制活性最好?；衔?f對(duì)灰葡萄孢、蕓苔鏈格孢、禾谷鐮孢和采絨革蓋菌的抑制活性均隨時(shí)間的增加而降低，對(duì)腐皮鐮孢和尖孢鐮孢的抑制活性隨時(shí)間的增加先升高后降低?；衔?g對(duì)灰葡萄孢、腐皮鐮孢、蕓苔鏈格孢和禾谷鐮孢的抑制活性受時(shí)間的影響較小，在測(cè)試時(shí)間內(nèi)抑制率均大于80%，4g對(duì)尖孢鐮孢和采絨革蓋菌的抑制活性均隨時(shí)間的增加而升高，第10天時(shí)的抑制活性最好?；衔?h對(duì)灰葡萄孢、腐皮鐮孢、蕓苔鏈格孢、禾谷鐮孢和尖孢鐮孢的抑制活性在測(cè)試時(shí)間內(nèi)變化較小，抑制率均大于80%，對(duì)采絨革蓋菌的抑制活性隨時(shí)間的增加先增加后趨于不變。

2.3 質(zhì)量濃度對(duì)脫氫樅基含氮衍生物抑菌活性的影響

研究了化合物4d、4f、4g和4h10天時(shí)在不同質(zhì)量濃度下對(duì)6種病原真菌的抑制活性，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知不同質(zhì)量濃度的4f、4g和4h對(duì)灰葡萄孢的抑菌率均大于95.00%，具有突出的抑制活性，抑制活性受質(zhì)量濃度的影響較小，但是質(zhì)量濃度對(duì)4d對(duì)灰葡萄孢的抑菌活性影響較大，11.25和45 mg/L時(shí)的抑制率為100.00%，22.5 mg/L時(shí)的抑制率僅為52.00%。4種樣品對(duì)尖孢鐮孢均具有較好的抑制活性，抑制活性受質(zhì)量濃度的影響較小，不同質(zhì)量濃度下的抑制率均大于70%，而對(duì)腐皮鐮孢、禾谷鐮孢、尖孢鐮孢和采絨革蓋菌的抑制活性受質(zhì)量濃度的影響較大。整體上，化合物4d對(duì)6種病原真菌的抑制活性最差，這可能是因?yàn)?d的苯環(huán)上還含有羥基，羥基的引入降低了含鹵原子的脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物的抑菌活性。并且，4d對(duì)6種病原真菌的抑制率隨質(zhì)量濃度的變化趨勢(shì)不一致，受質(zhì)量濃度的影響較大，但均在11.25 mg/L的抑制率較高?；衔?f、4g和4h對(duì)不同的植物病原真菌的抑制率隨質(zhì)量濃度的變化趨勢(shì)一致，4f在22.5 mg/L對(duì)6種病原真菌的抑制率最高，并且均大于95%，表明4f在22.5 mg/L時(shí)具有突出的抑菌性。而4g對(duì)6種病原真菌的抑制率隨質(zhì)量濃度的增加先降低后增加，在22.5 mg/L時(shí)抑制率最低，在其他質(zhì)量濃度下有較好的抑制活性(抑制率大于70%)。4h對(duì)6種病原真菌的抑制率隨質(zhì)量濃度的增加先降低后增加再降低，在45 mg/L時(shí)的抑制率較高。上述結(jié)果表明鹵原子的取代位置和類型均影響脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物在不同質(zhì)量濃度下的抑菌活性和最佳抑制活性的質(zhì)量濃度。

a.灰葡萄孢B. cinerea; b.腐皮鐮孢F. solani; c.禾谷鐮孢F. graminearum; d. 尖孢鐮孢F. oxysporum;e.蕓苔鏈格孢A. brassicae; f. 采絨革蓋菌C. versicolor圖3 脫氫樅基含氮衍生物在不同質(zhì)量濃度下的抑菌活性Fig.3 Inhibitory activity of dehydroabietyl nitrogen derivatives at different mass concentrations

3 結(jié) 論

3.1采用平板計(jì)數(shù)法研究了脫氫樅酸和23種脫氫樅基含氮衍生物對(duì)6種病原真菌的抑菌活性，結(jié)果表明：脫氫樅胺的抑菌活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于脫氫樅酸，脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物(4a～4i)的抑菌活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于脫氫樅酸酰胺衍生物(3a～3m)。在脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物苯環(huán)上引入鹵素原子較強(qiáng)地增加了其抑菌活性。當(dāng)質(zhì)量濃度為180 mg/L時(shí)，脫氫樅胺(對(duì)氯)水楊醛Schiff堿(4d)對(duì)灰葡萄孢和蕓苔鏈格孢的抑制率均為100%，脫氫樅胺(對(duì)氯)苯甲醛Schiff堿(4h)對(duì)灰葡萄孢、腐皮鐮孢和蕓苔鏈格孢的抑制率為100%，脫氫樅胺(間氟)苯甲醛Schiff堿(4f)和脫氫樅胺(對(duì)氟)苯甲醛Schiff堿(4g)在不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)部分病原真菌的抑制率也達(dá)到100%，與陽(yáng)性對(duì)照物放線菌酮的抑制活性相當(dāng)。

3.2進(jìn)一步研究了化合物4d、4f、4g和4h在不同質(zhì)量濃度下對(duì)6種病原真菌的抑菌活性。結(jié)果表明：4種化合物在不同質(zhì)量濃度下對(duì)灰葡萄孢和蕓苔鏈格孢具有較好的抑制活性，大于70%(4d在22.5 mg/L時(shí)除外)。苯環(huán)上鹵原子的取代位置和類型均會(huì)影響脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物在不同質(zhì)量濃度下的抑菌活性和最佳抑菌活性的質(zhì)量濃度。