miR-363通過PDZD2對骨肉瘤細(xì)胞調(diào)控的分子機(jī)制研究

何帆 江武 丁國明 范小良 朱六龍

骨肉瘤的發(fā)病率約占原發(fā)惡性骨腫瘤的15%～23%［1］，是兒童和青少年癌癥死亡的主要原因。miR-363在多種類型的癌癥中表現(xiàn)出腫瘤抑制作用，而其在骨肉瘤中的抑制功能還需要進(jìn)一步研究。PDZD2是促進(jìn)胰島瘤細(xì)胞增殖的多PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其在前列腺癌（AIPC）中被激活，是一種6-PDZ結(jié)構(gòu)的蛋白［2］。PDZD2在骨肉瘤發(fā)生中的作用目前仍不清楚。2016年12月至2019年3月作者通過實(shí)驗(yàn)研究，分析miR-363和PDZD2在骨肉瘤細(xì)胞MG-63中的功能及其相互作用，探討miR-363對骨肉瘤細(xì)胞的調(diào)控作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 骨肉瘤細(xì)胞株（MG-63，HOS和Saos2）和正常人成骨細(xì)胞株（hFOB1.19）均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。骨肉瘤細(xì)胞株用加入10%胎牛血清（FBS；美國Thermo Fisher Scientific公司）的DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone公司），37℃和5%CO2濃度條件下培養(yǎng)。hFOB 1.19細(xì)胞用DMEM/Ham's F12培養(yǎng)基（DMEM/F12；1：1w/w混合物）在34℃，5%CO2濃度條件下培養(yǎng)。GAPDH抗體，E-鈣黏著蛋白抗體，增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體，caspase-3抗體和波形蛋白抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；PDZD2抗體購自美國Abcam公司。miR-363模擬 物（5'-AAUUGCACGGUAUCCAUCU GUA-3'） 和陰 性 對 照（5'-UUCUCCGAACGUGU CACGUTT-3'）寡核苷酸序列購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。靶向 PDZD2（siRNA-PDZD2）的小干擾RNA（siRNA）（139，5'-GCUGAACUUUGCUGUGGGGAUU-3'；580，5'-CUCUG AACCAGGAGAAACAUU-3'； 和 1027，5'-GCUGGGAAUUCAGGUUAGUUU-3'），pcDNA 3.1-NEAT1和陰性對照購自廣州RiboBio 公司。PDZD2的psiCHECK2-UTR（野生型和突變型）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供。

1.2 RNA分離和逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR） 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)RNA分離方案，使用TRIzol試劑（美國Thermo Fisher Scientific公司）從組織或細(xì)胞系中提取總RNA。用于qPCR的反應(yīng)條件如下：95℃，60sec；然 后95℃，5s進(jìn) 行40循 環(huán)；然后60℃，34s。通過在ABI 7500快速序列檢測系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific公司）上使用SYBR Premix Ex Taq（大連Takara生物技術(shù)有限公司）對miR-363和PDZD2水平進(jìn)行定量。將miR-363和PDZD2的水平分別標(biāo)準(zhǔn)化為U6和GAPDH的水平。引物分別為：miR-363，正向5'-ACACTCCA GCTGGGAATTGCACGGTATCCATC-3'和 反 向5'-CT CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTAC AGATG-3'；U6，正向 5'-CTCG CTTCGGCAGCACA-3'和 反 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；PDZD2，正 向5'-TCTGTACTGTGTACCTCACCAA-3'和 反向 5'-CCCTGCGCTTTTCACCATAG-3'；GAPDH，正 向5'-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3'和 反 向5'-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3'。使用公式 2-△△Ct（21）計(jì)算mRNA表達(dá)的相對倍數(shù)變化。

1.3 蛋白質(zhì)印跡分析（Western blot） 用RIPA細(xì)胞裂解緩沖液（美國Santa Cruz Biotechnology公司）提取組織或細(xì)胞系中的總蛋白，并用BCA分析試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）確定這些蛋白的濃度。每組蛋白質(zhì)樣品（30μg）通過15%SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上（美國GE Healthcare），5%脫脂牛奶在室溫下封閉1h，用含0.1%Tween-20（TBST）的一抗，4℃孵育過夜。用TBST緩沖液洗滌，與二抗在室溫下孵育1h。最后，用ECL-Plus試劑（美國Millipore）觀察印跡。實(shí)驗(yàn)用GAPDH作為對照。

1.4 免疫熒光試驗(yàn) 采用免疫熒光試驗(yàn)測定腫瘤細(xì)胞中E-鈣粘蛋白，波形蛋白和PDZD2的水平。用含4%多聚甲醛的PBS液固定細(xì)胞。將細(xì)胞在-20℃下用100%甲醇滲透10分鐘，用含3%牛血清白蛋白（BSA）的PBS液封閉60min，然后加入一抗，4℃，孵育過夜（抗PDZD2為美國Abcam公司產(chǎn)品，抗E-鈣粘蛋白為美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品，抗波形蛋白為美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品）。PBS沖洗，并置于蓋玻片上，與偶聯(lián)有熒光染料的二抗在室溫下于黑暗中孵育1h。用DAPI染色細(xì)胞核后，中性樹膠固定，并在FV10i共聚焦顯微鏡（日本Olympus Corporation）下觀察細(xì)胞。

1.5 免疫組化 采用免疫組化測定PDZD2在腫瘤中的表達(dá)。把切片在二甲苯中孵育5min，依次用100%和95%乙醇孵育10min，進(jìn)行抗原暴露，然后在室溫下用3%過氧化氫將載玻片封閉30min。將切片與抗PDZD2的一抗在4℃孵育過夜，然后再接種抗二抗。使用EnVision檢測系統(tǒng)試劑盒（丹麥達(dá)格）評估免疫染色結(jié)果。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 接種MG-63細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞，分別用 miR-363 mimics（50nM），siRNA-PDZD2（1μg/ml）和相應(yīng)的陰性對照（NC）轉(zhuǎn)染24、48和72h。轉(zhuǎn)染方法參照100 nM Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.7 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活性 取轉(zhuǎn)染成功的MG-63細(xì)胞，按每1ml完全培養(yǎng)基加入10μl CCK-8將二者混合均勻后，每孔加入10μl CCK-8液，孵育1h，用酶標(biāo)儀在450nm處測量吸光度。CCK-8試劑盒為日本Dojindo Molecular echnologies公司產(chǎn)品。

1.8 克隆形成能力檢測 取轉(zhuǎn)染后的單細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度調(diào)整為1×103/ml；在培養(yǎng)板中分3種濃度接種細(xì)胞：分別接種50個(gè)細(xì)胞/孔、100個(gè)細(xì)胞/孔、200個(gè)細(xì)胞/孔；接種完畢后，所有孔中均補(bǔ)加培養(yǎng)基至液體量300μl/孔；在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2～3周；定時(shí)觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆時(shí)，即終止培養(yǎng)。去除上清液，加4%多聚甲醛液固定細(xì)胞20min。用結(jié)晶紫染料進(jìn)行細(xì)胞染色。染色成功后洗去未附著的染色液，細(xì)胞培養(yǎng)板置于空氣中自然晾干；最后拍照，計(jì)算細(xì)胞集落數(shù)。

1.9 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分析 Hoechst 33258檢測細(xì)胞凋亡：取轉(zhuǎn)染后的MG-63細(xì)胞，用4%低聚甲醛固定，將固定的細(xì)胞用0.1μg/ml的Hoechst 33258溶液（德國Sigma-Aldrich公司）染色，并在熒光顯微鏡（日本Olympus公司）下觀察核形態(tài)的變化，熒光的激發(fā)波長設(shè)定為460nm。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期：流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。將2μl膜聯(lián)蛋白V與2μl碘化丙啶（PI）（美國Thermo Fisher Scientific公司）混合，每流式管加入1×105個(gè)細(xì)胞，避光孵育30min，上機(jī)檢測。TUNEL分析：將腫瘤組織用福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm切片，使用細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒（日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社），按說明書對腫瘤切片進(jìn)行染色。隨機(jī)選擇每個(gè)切片的五個(gè)非重疊視野，并在熒光顯微鏡下觀察。為確定細(xì)胞周期的相位分布，將細(xì)胞用PI染色液（10μg/ml RNase A；50μg/ml PI）在37℃下避光染色30min，然后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.10 細(xì)胞侵襲能力檢測 Transwell小室試驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后的MG-63細(xì)胞加入到含0.2%BSA的無血清培養(yǎng)基中，調(diào)整培養(yǎng)基中細(xì)胞的密度為2×105個(gè)/ml。取調(diào)整好的細(xì)胞懸液，加入到Transwell小室上孔中，每孔內(nèi)接種2×104個(gè)細(xì)胞；然后再向Transwell小室的下室中加入含有10%FBS血清的完全培養(yǎng)基，每室加入700μl培養(yǎng)基。加注完成后將Transwell小室放入到二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中，箱內(nèi)條件為：5%CO2、37℃。培養(yǎng)48h后取出小室，將小室洗凈后，用結(jié)晶紫染色液進(jìn)行染色。將小室用中性樹脂封片。在OLYMPUS CX41正置顯微鏡下觀察小室與拍照，觀察時(shí)每個(gè)小室選取4個(gè)視野進(jìn)行測量，用IPP軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

1.11 動(dòng)物模型試驗(yàn) 將30只雄性小鼠（4～5周；20～22g；購自天津賽爾生物技術(shù)有限公司）置于25℃的無菌室中，進(jìn)行12h的明/暗循環(huán)，并在室溫下滅菌，可自由進(jìn)食、進(jìn)水。準(zhǔn)備已轉(zhuǎn)染miR-363mimics、miR-363（NC）和對照組人MG-63單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/ml，每只裸鼠后脅腹部皮下注射50μl細(xì)胞混懸液（每組10只小鼠）。從第2周起測量腫瘤的大小，1次/隔3d，計(jì)算腫瘤體積：V（cm3）=寬度2（cm2）×長度（cm）/2。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按照2-△△Ct方法處理數(shù)據(jù)［3］。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組或多組間比較用t檢驗(yàn)、單向方差分析或雙向方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外細(xì)胞試驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)miR-363可抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長 發(fā)現(xiàn)miR-363在骨肉瘤細(xì)胞株中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，其中MG-63細(xì)胞的miR-363低表達(dá)與其他骨肉瘤細(xì)胞相比較顯著。Hoechst染色表明，過表達(dá)miR-363的MG-63細(xì)胞具有較高的凋亡率（見圖1）。流式細(xì)胞儀結(jié)果表明miR-363過表達(dá)可以誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞中的G1/S阻滯（見圖2）。

圖1 Hoechst33258染色顯示miR-363過表達(dá)組細(xì)胞凋亡增多

圖2 流式細(xì)胞儀檢測顯示miR-363過表達(dá)組細(xì)胞中處于G1期的細(xì)胞數(shù)量增加，處于S期的細(xì)胞數(shù)量顯著減少

2.2 過表達(dá)miR-363可以調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）表型，從而抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力 Transwell小室試驗(yàn)表明，miR-363過表達(dá)后，MG-63細(xì)胞的侵襲能力受到抑制（見圖3）。免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果顯示，miR-363過表達(dá)后，上皮標(biāo)記E-鈣粘著蛋白的表達(dá)被上調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)記波形蛋白（Vimentin）被下調(diào)，細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA的表達(dá)降低，而caspase-3的裂解增加。

圖3 miR-363過表達(dá)組細(xì)胞侵襲能力減弱

2.3 PDZD2是miR-363的直接靶標(biāo)且可以在體外促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞MG-63細(xì)胞增殖 本研究利用在線預(yù)測軟件miRWalk 尋找miR-363的潛在靶標(biāo)，最后發(fā)現(xiàn)PDZD2為其靶基因。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)PDZD2 mRNA的3'非翻譯區(qū)（UTR）具有miR-363的結(jié)合位點(diǎn)；因此，在骨肉瘤細(xì)胞中研究PDZD2與miR-363的相互作用。結(jié)果表明，MG-63細(xì)胞中miR-363的過表達(dá)顯著抑制其產(chǎn)生PDZD2 mRNA和蛋白的能力（見圖4）。為確認(rèn)PDZD2是miR363的直接靶標(biāo)，將具有PDZD2全長3'UTR（野生型或突變型）的螢光素酶報(bào)道載體轉(zhuǎn)染到MG-63細(xì)胞中，用雙螢光素酶試驗(yàn)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-363 mimics削弱野生型PDZD2 3'UTR的螢光素酶活性，但未影響對照組的突變型PDZD2 3'UTR，表明miR-363直接靶向骨肉瘤細(xì)胞中的PDZD2，以降低PDZD2蛋白水平（見圖5）。

圖4 免疫熒光檢測MG-63細(xì)胞中PDZD2的表達(dá)

圖5 用全長3'UTR轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞（野生型和突變型）PDZD2，并使用螢光素酶報(bào)告基因法測定

2.4 骨肉瘤細(xì)胞中PDZD2蛋白水平降低的影響 在通過siRNA有效敲低MG-63細(xì)胞中PDZD2的表達(dá)后，測定細(xì)胞的凋亡，克隆形成能力和侵襲能力。結(jié)果表明，敲低PDZD2可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并減弱細(xì)胞的集落形成和侵襲能力。

2.5 miR-363通過下調(diào)體內(nèi)PDZD2水平限制腫瘤生長 結(jié)果表明，注射過表達(dá)miR-363的MG-63細(xì)胞的小鼠發(fā)展出明顯較小的腫瘤，顯示出生長延遲（見圖6）。對腫瘤組織mRNA和蛋白質(zhì)水平的檢測證實(shí)miR-363上調(diào)和PDZD2下調(diào)；通過檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡率證明miR-363在體內(nèi)顯著誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡（見圖7）。這些調(diào)節(jié)作用與PCNA表達(dá)降低，caspase-3裂解增加及EMT表型受損有關(guān)（見圖8）。

圖6 miR-363 mimics組的裸鼠體內(nèi)腫瘤生長速度較慢

圖7 TUNEL染色估算腫瘤切片中的細(xì)胞凋亡率（×200）

3 討論

骨肉瘤是一種間葉組織來源的惡性腫瘤。雖然對骨肉瘤形成過程中miRNA的致癌和抑癌功能已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，但miRNA調(diào)控的靶基因等分子機(jī)制仍待研究。本研究通過體外和體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑制因子miR-363在骨肉瘤細(xì)胞中被下調(diào)并通過直接靶向PDZD2促進(jìn)腫瘤生長。PDZD2最初被認(rèn)為是一種癌基因，其表達(dá)在前列腺腫瘤細(xì)胞系和人原發(fā)性前列腺腫瘤中上調(diào)。本研究表明PDZD2表達(dá)與骨肉瘤進(jìn)展有關(guān)。一項(xiàng)與腎細(xì)胞癌相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的最新研究表明，PDZD2的rs10054504與中國人群腎細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)［4］。本研究顯示，PDZD2的抑制促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡，并抑制骨肉瘤細(xì)胞系的遷移和侵襲能力。此外，PDZD2的敲低顯著降低細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA的表達(dá)，誘導(dǎo)caspase-3的裂解，并損害骨肉瘤細(xì)胞中的EMT表型。與miR-363/PDZD2相關(guān)的下游信號及其在骨肉瘤細(xì)胞中的功能有待進(jìn)一步研究。

腫瘤發(fā)生期間miRNA的失調(diào)是惡性轉(zhuǎn)化的標(biāo)志。抑癌基因miR-363屬于miR-92a家族，是一組高度保守的miRNA，包括miR-25，miR-92a-1，miR-92a-2和 miR-363［5］。已有研究顯示，miR-363-3p在具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌（CRC）組織標(biāo)本中被下調(diào)，從而通過增加體內(nèi)和體外SRY-box 4（Sox4）的表達(dá)促進(jìn)CRC細(xì)胞的遷移、侵襲并誘導(dǎo)EMT［6］。在前列腺癌中，PC-3細(xì)胞中高水平的miR-363通過靶向抑制MYC原癌基因來促進(jìn)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化并促進(jìn)EMT［7］。目前研究表明，骨肉瘤細(xì)胞中的miR-363水平被下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致其靶基因PDZD2的表達(dá)上調(diào)。在骨肉瘤細(xì)胞中恢復(fù)miR-363表達(dá)會(huì)損害細(xì)胞活力，集落形成，遷移和侵襲，同時(shí)通過PDZD2誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞周期停滯。這些影響可能與PCNA，caspase-3和EMT表型的降低有關(guān)。同樣，Wang等［8］研究認(rèn)為，miR-363通過靶向SOX4抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。表明，miR-363可以在多種類型的癌癥中充當(dāng)通用的腫瘤抑制因子?？傊琍DZD2作為骨肉瘤細(xì)胞中抑癌基因miR-363的新靶標(biāo)；miR-363的過表達(dá)或PDZD2的抑制可促進(jìn)caspase-3相關(guān)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制EMT，并誘導(dǎo)骨肉瘤消退。