基于UHPLC/MS的冠心病心絞痛血瘀證患者血清代謝組學(xué)研究

周耀中楊 濤季雪峰蔡文娟邵 燕沈秋生

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬常熟市中醫(yī)院，江蘇常熟215500； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海200120）

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新興學(xué)科，主要通過(guò)核磁共振氫譜、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)手段獲取代謝物的原始數(shù)據(jù)，以模式識(shí)別計(jì)算分析系統(tǒng)研究小分子物質(zhì)，幫助我們從海量的代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)中“跳”出來(lái)，一目了然地發(fā)現(xiàn)差異性代謝物，然后通過(guò)已知的代謝通路逆推出調(diào)節(jié)酶，最終完成疾病發(fā)病機(jī)制、藥物治療機(jī)制等研究，目前已應(yīng)用于腫瘤、肝病、心血管等疾病的診斷和療效評(píng)價(jià)。近年來(lái)，代謝組學(xué)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究也越來(lái)越廣泛[1]。

研究發(fā)現(xiàn)“血瘀”常貫穿冠心?。–HD）心絞痛發(fā)病始終，“血瘀證”是冠心病心絞痛最主要的證型[2]。辨證論治是中醫(yī)理論體系的核心，中醫(yī)“證”的精準(zhǔn)判識(shí)是提高中醫(yī)藥臨床療效的核心環(huán)節(jié)，而傳統(tǒng)的四診辨證受患者和臨床醫(yī)生主觀因素影響較大，缺乏客觀標(biāo)準(zhǔn)。因此，利用代謝組學(xué)技術(shù)開(kāi)展冠心病心絞痛血瘀證的客觀化研究有積極的臨床意義。

目前有學(xué)者開(kāi)展了有關(guān)冠心病血瘀證代謝組學(xué)的研究，但鑒于各個(gè)研究采用的技術(shù)方法、研究對(duì)象或者控制條件不同，鑒定出來(lái)的代謝產(chǎn)物也不盡相同[3-4]。且冠心病心絞痛血瘀證的發(fā)病是一個(gè)多因素、多層次的復(fù)雜過(guò)程，現(xiàn)有的標(biāo)記物難以從全面總體的角度對(duì)冠心病心絞痛血瘀證機(jī)制進(jìn)行闡釋。本研究采用最新的超高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC/MS）技術(shù)，以其強(qiáng)大的定性、定量分析能力對(duì)冠心病心絞痛血瘀證患者行非靶向血清代謝組學(xué)檢測(cè)，尋找其潛在的內(nèi)源性代謝標(biāo)志物，為冠心病心絞痛血瘀證客觀化研究提供新的思路和方法。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2015年5月至2016年5月上海曙光醫(yī)院確診為冠心病心絞痛的患者76例（已通過(guò)上海曙光醫(yī)院倫理委員會(huì)倫理審批，倫理審查批件號(hào)：2015-396-24-02）。其中冠心病心絞痛血瘀證組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)CHD血瘀證組）38例：男26例，女12例；平均年齡（65.89±1.79）歲；平均病程（8.26±0.78）年。冠心病心絞痛非血瘀證組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)CHD非血瘀證組）38例：男21例，女17例；平均年齡（64.74±1.52）歲；平均病程（6.39±0.64）年。另收集健康人38例作為健康對(duì)照組：男19例，女19例；平均年齡（62.13±1.52）歲。3組性別、年齡等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《慢性穩(wěn)定性心絞痛診斷與治療指南》[5]及《不穩(wěn)定性心絞痛和非ST段抬高心肌梗死診斷與治療指南》[6]；血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《冠心病血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)》[7]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）年齡大于18周歲且小于等于85周歲，性別不限；（2）符合冠心病心絞痛診斷標(biāo)準(zhǔn)（3）自愿參加，簽署知情同意書(shū)者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）伴急性心肌梗死者；（2）伴惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病或服用華法林者；（3）妊娠及哺乳期婦女；（4）無(wú)法判斷中醫(yī)證型或臨床資料不全者。1.5 主要儀器與試劑 儀器：UHPLC-Q/Exactive液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（Thermo，San Jose，CA，USA）；色譜柱ACQUITY UPLCHSS T3（2.1×100mm，1.8μm）（Waters，USA）；Avanti J-25I離心機(jī)（Beckman Coulter，USA）；VORTEX-GENIE 2渦 旋 混 合 器（Scientific Industries，USA）等。試劑：甲醇、甲酸、乙腈（均為色譜純，Thermo FISH USA）。

2 研究方法

2.1 樣品采集 患者入組后第2日清晨空腹抽取肘靜脈血5mL，4℃ 3000r/min離心15min，取上清后-80℃冰箱凍存?zhèn)錅y(cè)。

2.2 樣品預(yù)處理 血清樣品-80℃低溫冰箱取出后常溫下解凍融解，取100μL置入離心管，加入400μL乙腈以除蛋白，渦旋1min，離心（12000r/min 4℃）10min，取上清液550μL置入離心管，真空揮干。加入100μL 20%甲醇復(fù)溶，待測(cè)。

2.3 HPLC/MS檢測(cè)條件 色譜條件：流動(dòng)相組成，A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈。梯度洗脫，0～1min，10%B；1～2min，10%～20%B；2～5min，20%～50%B；5～10min，50%～85%B；10～19min，85%～95%B；19.1～21.0min，100%B。柱溫40℃，流速0.3mL/min，進(jìn)樣量5.0μL。質(zhì)譜參數(shù)：采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析，采用電噴霧離子源；離子源電噴霧電壓為+3.2KV/-2.8KV；毛細(xì)管溫度為320℃；毛細(xì)管電壓為75.0V；鞘氣流速為32.0a.u.；輔助氣流速為10.0a.u.。

2.4 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理 經(jīng)UHPLC/MC檢測(cè)得到的原始數(shù)據(jù)，首先利用SIEVE軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑、去燥，峰基線(xiàn)校正，再通過(guò)MetaboAnalyst 3.0完成數(shù)據(jù)預(yù)處理，隨后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Simca 14.1進(jìn)行建模判別分析。模式識(shí)別采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA），并行置換檢驗(yàn)，檢測(cè)OPLS-DA模型的穩(wěn)健性，避免相應(yīng)模式的過(guò)度擬合。

根據(jù)OPLS-DA模型中變量的VIP值對(duì)差異變量進(jìn)行篩選和可靠性驗(yàn)證（VIP值指變量投影重要性指標(biāo)，用來(lái)測(cè)度每一個(gè)自變量對(duì)解釋因變量的作用大小，若VIP值大于1，則表示該自變量因素對(duì)解釋因變量具有重要作用），再通過(guò)2組 t 檢驗(yàn)篩選組間顯著性差異大的化合物（P＜0.05），利用HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)檢索數(shù)據(jù)，對(duì)照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)差異變量進(jìn)行鑒定，并且借助KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)相關(guān)的代謝通路。

3 研究結(jié)果

3.1 總離子流圖 生物樣本中眾多代謝物得到了很好的分離，保留時(shí)間在21min以?xún)?nèi)。詳見(jiàn)圖1。

3.2 主成分分析 3組樣品分布見(jiàn)初步分離趨勢(shì)，CHD非血瘀證組和健康組樣品分布有部分重疊。詳見(jiàn)圖2。

3.3 正交偏最小二乘法-判別分析 由于主成分的局限性，同時(shí)為了獲得各組間顯著差異的代謝物信息，我們進(jìn)一步采用具有監(jiān)督性的多維統(tǒng)計(jì)方法即OPLSDA。同時(shí)，對(duì)每一個(gè)OPLS-DA得分圖行置換檢驗(yàn)，防止模型過(guò)度擬合。

3.3.1 CHD血瘀證組與健康組比較 CHD血瘀證組和健康組也可以被區(qū)分，CHD血瘀證組出現(xiàn)部分樣品的集中分離，置換檢驗(yàn)結(jié)果示模型可靠，不存在過(guò)度擬合。詳見(jiàn)圖3。

圖1 CHD血瘀證組、CHD非血瘀證組、健康組血清樣品總離子流圖

圖2 CHD血瘀證組、CHD非血瘀證組、健康組主成分分析得分圖

3.3.2 CHD非血瘀證組與健康組比較 CHD非血瘀證組和健康組可以被區(qū)分，CHD非血瘀證組也出現(xiàn)部分?jǐn)?shù)據(jù)的集中分離，置換檢驗(yàn)結(jié)果示模型可靠。詳見(jiàn)圖4。

3.3.3 CHD血瘀證組與CHD非血瘀證組比較 CHD血瘀證組和CHD非血瘀證組可以被區(qū)分，且置換檢驗(yàn)結(jié)果示模型可靠。詳見(jiàn)圖5。

3.4 生物標(biāo)志物的篩選及鑒定 結(jié)合OPLS-DA模型中變量的VIP值（設(shè) 置VIP值＞1），刪 除2組間沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）的變量，共找到12種代謝物在各組間有明顯變化，結(jié)果見(jiàn)表1。找到4種代謝物在CHD血瘀證組和CHD非血瘀證組之間具有顯著差異（VIP＞1且P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)表2。

圖3 CHD血瘀證組和健康組OPLS-DA得分圖及置換檢驗(yàn)圖

圖4 CHD非血瘀證組和健康組OPLS-DA得分圖及置換檢驗(yàn)圖

圖5 CHD血瘀證組和CHD非血瘀證組OPLS-DA得分圖及置換檢驗(yàn)圖

表1 各組血清代謝物質(zhì)含量比較（±s）

表1 各組血清代謝物質(zhì)含量比較（±s）

注：◆與健康組比較，P＜0.05；▲與CHD非血瘀證組比較，P＜0.05。

?

表2 CHD血瘀證組和CHD非血瘀證組差異性代謝產(chǎn)物比較

4 討論

從代謝組學(xué)的觀點(diǎn)而言，“證”是人體代謝網(wǎng)絡(luò)功能發(fā)生變化后的一種特異性狀態(tài)。通過(guò)分析代謝模式形成的機(jī)制和過(guò)程，可找出冠心病心絞痛血瘀證發(fā)生發(fā)展的潛在原因，并可能揭示其生物學(xué)本質(zhì)。本研究找到4種冠心病心絞痛血瘀證的潛在代謝標(biāo)志物，按VIP值大小依次為檸檬酸、肉毒堿、組氨酸、黃嘌呤。正是這些標(biāo)志物區(qū)分了冠心病心絞痛血瘀證患者與非血瘀患者及健康人不同的代謝模式，同時(shí)也反映其病理生理相對(duì)應(yīng)的代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生異常后代謝物質(zhì)和功能的改變。

檸檬酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，冠心病心絞痛血瘀證患者因血脈瘀滯常存在嚴(yán)重的冠脈病變，心肌持續(xù)缺血缺氧，能量代謝障礙造成了檸檬酸生成不足[8]。肉毒堿主要生理作用是轉(zhuǎn)運(yùn)脂酰輔酶A通過(guò)線(xiàn)粒體內(nèi)膜進(jìn)入線(xiàn)粒體基質(zhì)進(jìn)行β氧化提供能量，具有促進(jìn)缺血心肌脂肪代謝，改善機(jī)體能量供應(yīng)的作用[9]，本次研究中CHD血瘀證組肉毒堿含量的升高可能是血瘀證患者為對(duì)抗脂肪代謝異常，啟動(dòng)的保護(hù)機(jī)制。組氨酸可以在組氨酸脫羧酶的催化下生成組胺，在應(yīng)激條件下，組胺的過(guò)度激活可誘發(fā)冠脈收縮，冠脈血流減少，而且可以通過(guò)擾亂心肌線(xiàn)粒體和內(nèi)皮功能加重心肌缺血，其釋放水平與心肌缺血程度呈正相關(guān)[10]，提示CHD血瘀證組的心肌缺血程度更加嚴(yán)重。黃嘌呤是嘌呤分解代謝的中間產(chǎn)物，在黃嘌呤氧化酶作用下生成尿酸，血尿酸水平升高是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，也是反應(yīng)冠心病嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。本研究中CHD血瘀證組黃嘌呤含量更高，提示CHD血瘀證組出現(xiàn)嘌呤分解代謝紊亂更加敏感，缺血的心肌核苷酸代謝被激活，嘌呤分解代謝失常，引起中間代謝產(chǎn)物蓄積。

本次研究主要是利用代謝組學(xué)技術(shù)探索冠心病血瘀證辨證的生物學(xué)基礎(chǔ)，找到了冠心病心絞痛血瘀證潛在的內(nèi)源性標(biāo)志物，這些有特異性的物質(zhì)有望成為活血化瘀中藥的干預(yù)靶點(diǎn)，為下一步開(kāi)展中醫(yī)藥治療冠心病心絞痛的研究提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在后續(xù)的研究中，可以擴(kuò)大代謝組學(xué)研究的樣本量，利用不同的檢測(cè)方法，進(jìn)行相互驗(yàn)證，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性、客觀性。同時(shí)，如條件允許，可以進(jìn)行多個(gè)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)的綜合研究，更好地解釋彼此之間的相關(guān)性。