益氣活血方介導(dǎo)P38MAPK信號通路促進突出椎間盤組織重吸收的機制研究

高春鵬朱 宇姜 宏劉建文

（1.泰興市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇泰興225400； 2.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇蘇州215009；3.華東理工大學(xué)生物工程與藥學(xué)院國家重點實驗室，上海200237）

腰椎間盤突出癥（Lumbar intervertebral disc herniation，LIDH）是臨床常見病、多發(fā)病。近年來，腰椎間盤突出后發(fā)生影像學(xué)重吸收的報道日益增多[1-2]。LIDH患者在無化學(xué)融核和外科干預(yù)的情況下，突出髓核自發(fā)消失或者變小的現(xiàn)象稱為“重吸收”（resorption）[3]。前期基礎(chǔ)研究及臨床觀察隨訪發(fā)現(xiàn)，姜宏經(jīng)驗方“益氣活血方”能明顯改善LIDH患者的臨床癥狀并促進重吸收的發(fā)生[4]。新的研究發(fā)現(xiàn)，P38絲裂原活化蛋白激酶（P38 mitogenactivated protein kinases，P38MAPK）信號通路能夠通過調(diào)控細(xì)胞因子表達及細(xì)胞凋亡參與椎間盤的退變[5]。因此我們推測，益氣活血方刺激突出髓核組織的新生血管化和細(xì)胞外基質(zhì)的代謝失衡，促進突出髓核組織的重吸收與38MAPK信號通路的過度激活有關(guān)。本實驗旨在觀察并對比益氣活血方和P38MAPK特異性阻斷劑對大鼠突出髓核的組織結(jié)構(gòu)和組織中基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP-3）、MMP-9、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及P38MAPK基因和蛋白表達的影響，探討益氣活血方促進破裂型椎間盤突出重吸收的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物與分組 選擇3月齡體重在180～220g的SD雄性大鼠30只，由上海Slac實驗動物有限責(zé)任公司提供，合格證號：SCXX（滬）2015-0005。

1.2 藥物、主要儀器和試劑 中藥益氣活血方（蘇州市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科提供），藥物組成：生炙黃芪（各）20g、當(dāng)歸10g、川芎15g、炒白術(shù)10g、防己10g、木瓜10g、威靈仙10g、地龍15g、水蛭6g、白芥子6g，加冷水500mL浸泡30min，煎煮（火力2100W）開鍋后 煎30min取 汁200mL，再 加 水300mL煎30min取汁200mL，2次相兌并濃縮成1.5g/mL煎劑保存于恒溫冰箱中。MMP-3抗體、MMP-9抗體、VEGF抗體、P38MAPK抗體，proteintech公司；磷酸化P38絲裂原活化蛋白激酶（P-P38MAPK）抗體，Santa Cruz公司；DMSO，蘇州昆山金城試劑廠；P38MAPK特異性阻斷劑，SB203580（S1076），Selleck Chemicals公司；總RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、EasyTaq PCR試劑盒，Gibico公司；熒光定量PCR試劑盒，華北制藥股份有限公司；TL-18M臺式高速冷凍離心機，上海離心機械研究所；SW-CJ-1FD超凈工作臺，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SBE6003電泳儀，上海申能博彩生物有限公司；PCR基因擴增儀，Bio-Rad公司；iCycler熒光定量PCR儀，Eppendorf公司；XSP-17C倒置生物顯微鏡，上海長方光學(xué)儀器有限公司；Ti-S熒光顯微鏡，日本尼康公司；高效液相色譜儀，島津國際貿(mào)易有限公司。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 大鼠采用完全隨機分組分為對照組、中藥組和中藥+P38阻斷劑組，每組10只。3組采用同一術(shù)式造模，5只1籠，室溫22℃，通風(fēng)良好，12h光照循環(huán)（6：00—18：00）。

獲取尾椎（Co）椎間盤：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，腹腔注射鹽酸氯胺酮（0.10g/kg）麻醉，背部L5附近備皮，常規(guī)消毒，在無菌條件下切取大鼠第3、4尾椎椎間盤（包含上下軟骨終板）。使用7號注射器針頭（內(nèi)徑0.5mm、外徑0.7mm）刺破所取椎間盤的纖維環(huán)，使髓核組織暴露，用萬分之一單位電子天平稱重并記錄，隨后將尾椎椎間盤放置于無菌聚碳酸酯（PC）管套并浸泡在生理鹽水中備用。前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)3月齡SD雄性大鼠第3、4尾椎椎間盤的直徑為（3.56±0.42）mm，高為（3.18±0.40）mm。

植入椎間盤：以第5腰椎為中心，沿背部皮膚后正中線切約2.5cm縱形切口，分離筋膜及肌肉組織（背最長肌、多裂?。?，暴露L4、L5的棘突和椎板，用骨鉗咬除L4、L5棘突及全部椎板和部分椎弓根，并用7號針頭穿破黃韌帶并劃破硬脊膜（使尾椎椎間盤接觸腦脊液，模擬椎管內(nèi)環(huán)境），劈開骨缺口附近豎脊肌，用血管鉗擴大肌肉裂隙成一空腔。將已固定在PC管套中的Co3、4椎間盤植入空腔內(nèi)，逐層縫合，切口涂抹紅霉素眼膏以預(yù)防感染。待大鼠蘇醒，可正?；顒雍蠓湃牖\中正常飼養(yǎng)。

2.2 藥物干預(yù) 造模后第2日，開始藥物干預(yù)。對照組予生理鹽水灌胃并腹腔注射2%DMSO（10mg/kg），1次/d；中藥組予益氣活血方煎劑按9.1mL/kg劑量1次/d灌胃，同時腹腔注射2%DMSO（10mg/kg，1次/d）；中藥+P38阻斷劑組予腹腔內(nèi)注射P38MAPK的阻斷劑SB203580（使用前用2%DMSO稀釋，10mg/kg，1次/d），同時等體積生理鹽水灌胃。各組均連續(xù)藥物干預(yù)4周。灌胃給藥劑量根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”臨床等效劑量=臨床用量×等效劑量系數(shù)（0.018）計算得出。

2.3 取材 于藥物干預(yù)4周后將各組大鼠麻醉處死，沿原手術(shù)切口打開背部肌肉，取出包埋的椎間盤去除PC管套后迅速用電子天平稱重并記錄。將椎間盤分為2份分別標(biāo)號：一份放入10%的中性甲醛固定液細(xì)胞固定24h，制備4μm厚的組織切片標(biāo)本，行HE染色；另一份用0.01mmol/L磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗去血漬后放入已標(biāo)記的無菌EP管中，于-80℃冰箱中保存。預(yù)留用于Real Time PCR、Western Blot等檢測。

根據(jù)教學(xué)目標(biāo)以及學(xué)生已有的知識經(jīng)驗，找到本節(jié)課的知識生長點，準(zhǔn)確定位要解決的核心問題。例如“正比例的意義”這節(jié)課，教學(xué)目標(biāo)如下表：

2.4 HE染色觀察組織退變情況 切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水化，蘇木素染色10min，沖洗，并用氨水返藍(lán)，孵育后水洗置于0.5%伊紅染色1min，70%乙醇浸泡分化5min后，水洗并鏡檢。常規(guī)脫水，透明，封片。

2.5 Real Time PCR方法檢測目的基因的mRNA表達 提取總RNA：按Gibico公司RNA抽提試劑盒說明書，應(yīng)用Trizol試劑溶液提取各組NPCs的總RNA。反轉(zhuǎn)錄：在超凈臺中，取DEPC處理的200μL PCR管置冰上，依次加入1μg總RNA，1.0μL cDNA模板，加入Forward Primer（20μmol/L）和Reverse Primer（20μmol/L）各0.25μL，0.125μL Taq酶，2μL dNTP，1.5μL MgCl2（25mmol/L），2.5μL 10×Buffer緩沖液，加入17.375μL的ddH2O，使反應(yīng)體系總體積達到25.0μL，于42℃反轉(zhuǎn)錄1h，獲取cDNA。通過Real-time PCR對TNF-α、IL-1β、P38MAPK、MMP-3、MMP-9進行擴增，引物序列以基因管家GAPDH為內(nèi)參，利用Primer premier 5.0為待測基因設(shè)計引物序列，見表1。

表1 引物序列

PCR反應(yīng)：95℃條件下，5min預(yù)變性，30s變性，56～65℃30s退火（所有的引物的退火溫度58℃），72℃條件下延伸重復(fù)35個循環(huán)，每次循環(huán)讀取CT（cycle threshold）值，72℃ 5min最終延伸。每0.2℃讀取CT值，繪制裂解曲線。

瓊脂糖凝膠電泳：點樣法取內(nèi)參擴增產(chǎn)物及PCR產(chǎn)物與6×DNA Loading Buffer混勻，微量移液器上樣。120V電壓進行電泳約30min。當(dāng)溴酚藍(lán)在凝膠中遷移適當(dāng)距離后，停止電泳，拿出凝膠，在紫外透射下觀察目的條帶，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

所有的原始數(shù)據(jù)均借助實時定量PCR儀所附帶的軟件來完成，標(biāo)記跟蹤待測基因，最后與標(biāo)準(zhǔn)曲線進行對比，通過CT值表示相關(guān)基因的表達水平。我們對每一個基因的樣品都相對獨立地重復(fù)3次（n=3），取CT平均值代表基因在該條件下的mRNA水平。每份待測基因的CT值與內(nèi)參GAPDH的比值作為各組mRNA的相對表達量。

2.6 Western Blot方法檢測蛋白表達 根據(jù)說明書提取椎間盤組織的總蛋白并按BCA蛋白定量法對細(xì)胞核濃度進行定量，配制10%SDS-聚丙烯酰胺分離膠，在電泳儀上對等量蛋白進行電泳，分離蛋白質(zhì)，根據(jù)待測蛋白大小分別進行轉(zhuǎn)膜。用TBST緩沖液漂洗后置于封閉液中封閉2h，室溫下加入配制好的1mL一抗溶液，4℃孵育過夜?；厥找豢购螅尤攵?7℃孵育2h。

TBST漂洗后，將PVDF膜放入免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑中進行顯影，通過計算機圖像處理技術(shù)（Quantity One）測定各蛋白條帶的灰度值，以待測基因的灰度面積與內(nèi)參照β-actin的灰度面積的比值為半定量資料，重復(fù)3次，并進行統(tǒng)計分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組椎間盤質(zhì)量改變比較 對照組椎間盤質(zhì)量減小值為（8.17±5.19）mg，中藥組為（19.29±5.34）mg，中藥+P38阻斷劑組為（11.91±6.88）mg，中藥組椎間盤質(zhì)量減小值明顯高于其他2組（P＜0.05），提示益氣活血方能促進突出椎間盤的縮小和重吸收。

3.2 HE染色觀察各組椎間盤組織形態(tài) 中藥組椎間盤較其他2組形態(tài)退變更為明顯，光鏡下見纖維環(huán)膠原纖維排列紊亂，細(xì)胞核染色數(shù)量減少，細(xì)胞基質(zhì)膠凍樣改變，并伴有大量炎性細(xì)胞和新生血管浸潤，見圖1。椎間盤形態(tài)退變程度與質(zhì)量減小趨勢一致。

3.3 各組椎間盤VEGF、P38MAPK、MMP-9、MMP-3的mRNA表達比較 結(jié)果見表2。

3.4 各組髓核組織P-P38MAPK、P38MAPK、VEGF、MMP-9、MMP-3的蛋白表達比較 結(jié)果見表3。

圖1 尾椎髓核組織HE染色（×20）

表2 各組椎間盤VEGF、MMP-3、MMP-9、P38MAPK的基因相對表達量比較（±s）

表2 各組椎間盤VEGF、MMP-3、MMP-9、P38MAPK的基因相對表達量比較（±s）

注：*與對照組比較，P＜0.05；#與中藥+P38阻斷劑組比較，P＜0.05。

對照組　10　1.00±0.03　1.00±0.30　1.00±0.10　1.00±0.02中藥組　10　3.56±0.04*#　5.67±1.30*#　4.15±0.23*#　7.86±0.27*#中藥＋P38阻斷劑組　10　1.14±0.08　1.97±0.31　3.51±0.24　3.28±0.47

表3 各組椎間盤VEGF、MMP-3、MMP-9、P-P38MAPK、P38MAPK的蛋白表達比較（±s）

表3 各組椎間盤VEGF、MMP-3、MMP-9、P-P38MAPK、P38MAPK的蛋白表達比較（±s）

注：*與對照組比較，P＜0.05；#與中藥+P38阻斷劑組比較，P＜0.05。

對照組　1 0　0.865±0.047　0.721±0.023　0.777±0.028　1.079±0.017　0.812±0.040中藥組　1 0　1.463±0.100*#　1.657±0.032*#　0.905±0.038*#　1.746±0.032*#　1.079±0.065*#中藥+P38阻斷劑組　1 0　0.711±0.041*　0.657±0.021　0.670±0.025*　1.275±0.020*　0.785±0.040

4 討論

LIDH可歸屬于中醫(yī)學(xué)“腰腿痛”“痹證”范疇，證屬氣滯血瘀。這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對LIDH是由突出物壓迫導(dǎo)致神經(jīng)根瘀血、水腫，伴發(fā)各種炎癥介質(zhì)刺激引發(fā)微循環(huán)障礙的病理認(rèn)識具有相通之處。課題組姜宏教授結(jié)合中醫(yī)傳統(tǒng)理論和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，本病的辨證重點應(yīng)抓住“虛”“瘀”二字，故擬“益氣活血”為本病的治療大法，研制了治療LIDH的專方“益氣活血方”，此方能顯著改善LIDH患者的臨床癥狀并能促進突出組織的重吸收。方中重用黃芪為君藥，大補脾肺之元氣，使氣旺則血行，血行則濕散，現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示黃芪可提高自身免疫效應(yīng)[6]；當(dāng)歸配伍川芎，既能養(yǎng)血和血，又能活血化瘀，其有效成分川芎嗪能改善血液流變學(xué)，促進新生血管的形成，并能夠降低血小板的黏附，緩解突出物壓迫引起的神經(jīng)根瘀血、缺血、水腫[7]。君臣配伍起到益氣活血的功效。白術(shù)、防己二藥合用有利水消腫之效，威靈仙可宣通十二經(jīng)絡(luò)，又有“化骨除鯁”之能，木瓜、白芥子祛濕通絡(luò)，5味佐藥能夠減輕神經(jīng)根和脊髓的水腫。地龍、水蛭通絡(luò)散結(jié)，祛瘀生新。諸藥配合，達到益氣、活血、祛痰、通絡(luò)的功效。

近年來大量研究表明，突出組織的新生血管化、細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡以及椎間盤細(xì)胞的凋亡是導(dǎo)致椎間盤突出重吸收的主要原因。VEGF作為一種血管生長刺激因子，其高表達可作為突出組織新生血管化的標(biāo)志。研究表明新生血管化可誘導(dǎo)以血管反應(yīng)為中心的免疫性炎癥，并刺激多種蛋白水解酶的釋放，加速椎間盤組織退變（IDD）[8]。ECM的代謝失衡和突出髓核組織的細(xì)胞凋亡是IDD主要原因[9]。MMPs是ECM代謝的關(guān)鍵酶類，其高表達一方面能直接降解絕大部分ECM成分（除外蛋白多糖）；另一方面可以通過弱化細(xì)胞-基質(zhì)的黏附加速椎間盤細(xì)胞的凋亡[10]。研究顯示，MMPs家族中MMP-3、MMP-9是加速ECM降解及軟骨破壞的關(guān)鍵因素，其高表達能夠?qū)е伦甸g盤組織的IDD，從而促進重吸收過程[11]。

Studer[12]在外培養(yǎng)的髓核細(xì)胞加入P38MAPK抑制劑后能逆轉(zhuǎn)由TNF-α誘導(dǎo)的MMPs/TIMPs比值升高的趨勢，表明P38MAPK信號通路能夠調(diào)控MMPs的表達從而在椎間盤ECM降解過程中起著至關(guān)重要的作用。因此，本研究提出益氣活血方通過介導(dǎo)38MAPK信號通路加速突出髓核組織的新生血管化和細(xì)胞外基質(zhì)的代謝失衡，促進突出髓核組織的重吸收的假設(shè)。

本實驗結(jié)果表明益氣活血方能夠激活P38MAPK的磷酸化，促進突出髓核組織中VEGF、MMP-3、MMP-9的基因和蛋白表達，促進突出椎間盤組織的新生血管化和ECM的降解，加速突出組織的重吸收過程；而中藥+P38阻斷劑組無論是椎間盤組織形態(tài)還是VEGF、MMP-3、MMP-9的基因和蛋白表達均受到明顯抑制。由此可見，益氣活血方上調(diào)VEGF、MMP-3、MMP-9的基因和蛋白表達，促進突出組織重吸收的作用主要通過介導(dǎo)P38MAPK信號通路的磷酸化實現(xiàn)。

然而，P38MAPK的磷酸化能夠提高VEGF的表達，促進突出椎間盤組織的新生血管化，這勢必加重患者突出部位的炎性疼痛，但臨床上大多服藥患者并無腰痛加重的癥狀?？紤]可能為中藥復(fù)方中不同組分在體內(nèi)除調(diào)控P38MAPK信號通路外，還與其他幾條經(jīng)典信號通路之間存在調(diào)節(jié)關(guān)系，具體原因有待進一步剖析該方的作用機制以及P38MAPK與其他幾條經(jīng)典信號通路之間的聯(lián)系。