利用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化當(dāng)歸黃芪廢藥渣發(fā)酵生產(chǎn)微生物絮凝劑的研究

熊悅悅 陳嘉怡 黎玨綺 梁紫妍 陳美如 王立英

摘 要 本實(shí)驗(yàn)旨在當(dāng)歸黃芪廢藥渣中尋找和利用具有絮凝活性且繁殖周期短的微生物做絮凝劑，解決中藥渣處理不當(dāng)帶來(lái)的問(wèn)題，同時(shí)實(shí)現(xiàn)資源循環(huán)利用、中藥渣無(wú)毒降解的目的。

關(guān)鍵詞 半合成培養(yǎng)基 廢藥渣 微生物絮凝劑 正交實(shí)驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào)：X703.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

0前言

近年來(lái)，使用食療同源的中醫(yī)藥來(lái)治病越來(lái)越得到人們的重視，并且隨著中醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的持續(xù)發(fā)展，中藥制劑備受?chē)?guó)內(nèi)外人們的歡迎，因此中藥生產(chǎn)和開(kāi)發(fā)的力度也隨之增大。然而，中藥材生產(chǎn)和加工后不斷堆積產(chǎn)生的殘余藥渣不僅浪費(fèi)資源，還在一定程度上出現(xiàn)污染環(huán)境等一系列問(wèn)題。大多數(shù)中藥生產(chǎn)和開(kāi)發(fā)的企業(yè)在中藥廢渣的處理上由于人力、技術(shù)、物力等不充足的原因，采用焚燒、埋掉等簡(jiǎn)便卻不環(huán)保的處置方式;同時(shí)，廢藥渣含水量比較高，導(dǎo)致極易出現(xiàn)腐爛變質(zhì)等問(wèn)題?？梢?jiàn)，提倡循環(huán)利用廢藥渣的處理方式對(duì)減少土地資源占用、降低對(duì)環(huán)境的污染、節(jié)約大量的資金均有著十分重要作用，廢藥渣處置方式和循環(huán)利用已經(jīng)成為當(dāng)今中藥企業(yè)和研究所的研發(fā)的焦點(diǎn)。綜上，目前對(duì)于廢藥渣生態(tài)循環(huán)利用有：廢藥渣中提取物的回收利用、在飼料的添加劑應(yīng)用、食用菌栽培中的應(yīng)用、在生產(chǎn)沼氣方面的應(yīng)用等等。

本實(shí)驗(yàn)將廢藥渣變廢為寶，將其發(fā)酵生成微生物絮凝劑，同時(shí)將它當(dāng)作微生物絮凝劑特定的培養(yǎng)基，對(duì)中藥渣實(shí)現(xiàn)了變廢為寶、資源循環(huán)利用的處理。與傳統(tǒng)的人工絮凝劑相對(duì)比，天然微生物絮凝劑的現(xiàn)狀微生物作為生物類(lèi)絮凝劑是由它本身和其產(chǎn)生的代謝物而組成，這些物質(zhì)可以把某一些污水的懸浮微粒、化學(xué)物質(zhì)等等絮凝沉降下來(lái)。同時(shí)，微生物類(lèi)絮凝劑不僅有絮凝沉降污水的效能，還具有自我降解的能力，這是未來(lái)一類(lèi)綠色環(huán)保型的絮凝劑。Kurane等研究者從紅平紅球菌中發(fā)酵生成微生物絮凝劑NOC-1，曾被視為最有效的微生物絮凝劑，還具備很好的絮凝活性和脫色能力。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)法，在液體培養(yǎng)基中對(duì)微生物絮凝劑MF1進(jìn)行優(yōu)化，再用優(yōu)化前、后的MBF1（1號(hào)菌）對(duì)湖水進(jìn)行處理，并測(cè)得絮凝活性和化學(xué)耗氧量，來(lái)驗(yàn)證優(yōu)化培養(yǎng)基的效果。

1材料與方法

1.1藥渣來(lái)源

當(dāng)歸黃芪廢藥渣源于大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目制備當(dāng)歸補(bǔ)血口服液殘余的大量廢藥渣，當(dāng)歸補(bǔ)血口服液的中藥配比：當(dāng)歸（甘肅-聚和泰）：黃芪（甘肅-聚和泰）=1：2.5。

1.2培養(yǎng)基類(lèi)型

用PDA培養(yǎng)基分離純化;用藥渣查氏的固體培養(yǎng)基來(lái)初篩和復(fù)篩;藥渣液體發(fā)酵培養(yǎng)基來(lái)發(fā)酵富集微生物絮凝劑。

1.3主要試劑

高嶺土、氯化鈣、標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液、濃硫酸溶液（1：3）、標(biāo)準(zhǔn)草酸鈉溶液。

1.4實(shí)驗(yàn)儀器

1.5菌種來(lái)源

從中藥渣分離獲得5種菌株，取絮凝活性較好的1號(hào)菌，委托北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司進(jìn)行測(cè)序，最后結(jié)果顯示：1號(hào)菌與Acremonium sp. TC-1-N1-1親源關(guān)系最近，是一種枝頂孢霉屬菌種。

2實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

方法：利用微生物分離純化的方法，從廢藥渣中分離出，即能在廢藥渣培養(yǎng)基中生長(zhǎng)且有絮凝劑活性的微生物菌株;經(jīng)過(guò)復(fù)篩，篩選出絮凝活性較好且繁殖周期短的MBF1（1號(hào)菌），先進(jìn)行初步鑒定，再委托學(xué)校外的基因檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行基因鑒定;最后，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)MBF1的半合成培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，再用優(yōu)化前、后的MBF1對(duì)湖水進(jìn)行處理，并測(cè)其絮凝活性和化學(xué)耗氧量，來(lái)驗(yàn)證優(yōu)化培養(yǎng)基的效果。

結(jié)果：葡萄糖濃度（25g/L），藥渣濃度（7g/L），尿素濃度（0.1g/L），初始pH（7），時(shí)間（48h）;優(yōu)化后MBF1的結(jié)果：MBF1的絮凝活性可達(dá)66.52%，對(duì)湖水化學(xué)需氧量降低了1.25 mg/L。

2.1當(dāng)歸黃芪廢藥渣的發(fā)酵工藝

2.2正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，制作5因素4水平的正交試驗(yàn)水平表（表2）。

根據(jù)發(fā)酵條件和半合成液體培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗(yàn)，進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：葡萄糖濃度與培養(yǎng)時(shí)間對(duì)MBF1絮凝率有比較顯著影響（表2），而藥渣濃度、初始pH和尿素濃度對(duì)MBF1沒(méi)有特別顯著影響。結(jié)合表4可知，發(fā)酵MBF1的最佳條件是：葡萄糖濃度：25g/L，藥渣濃度：7g/L，尿素濃度：0.1g/L，初始pH：7，培養(yǎng)時(shí)間：48h。

2.3對(duì)比優(yōu)化培養(yǎng)基前后對(duì)湖水的處理效果

2.3.1絮凝率測(cè)定

2.3.2湖水的化學(xué)需氧量

通過(guò)湖水化學(xué)需氧量的測(cè)定（見(jiàn)表6），結(jié)果顯示：優(yōu)化后的半合成藥渣培養(yǎng)基發(fā)酵的MBF1比原半合成培養(yǎng)基化學(xué)需氧量降低了1.25 mg/L。

3討論

當(dāng)歸黃芪中藥渣不僅可以發(fā)酵生產(chǎn)微生物絮凝劑，還可以做微生物的半合成培養(yǎng)基，從而達(dá)到變廢為寶、綠色環(huán)保的目的。由于當(dāng)歸黃芪藥渣中主要?dú)埩袅舜罅康奶穷?lèi)和蛋白質(zhì)類(lèi)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇葡萄糖濃度、尿素濃度、藥渣溶液濃度、初始pH、和培養(yǎng)時(shí)間作為5個(gè)考察因素，采用5因素4水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化的發(fā)酵條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MBF1產(chǎn)絮凝劑的影響排序?yàn)椋号囵B(yǎng)時(shí)間>葡萄糖濃度>尿素>初始pH>藥渣濃度;再根據(jù)數(shù)據(jù)分析，葡萄糖濃度、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)MBF1絮凝率有較為明顯的影響，而尿素、藥渣濃度和初始pH對(duì)MBF1沒(méi)有特別明顯的影響。結(jié)合正交試驗(yàn)的分析，最佳水平：葡萄糖濃度：25g/L，藥渣濃度：7g/L，尿素濃度：0.1g/L，初始pH：7，培養(yǎng)時(shí)間：48h。在最佳條件下發(fā)酵MBF1，并對(duì)周邊的湖水進(jìn)行化學(xué)耗氧量的測(cè)定，優(yōu)化后的MBF1比原半合成液體培養(yǎng)基化學(xué)需氧量降低了1.25 mg/L。

4結(jié)論

通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)法，在半合成液體培養(yǎng)基中對(duì)微生物絮凝劑MF1進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的發(fā)酵條件：葡萄糖濃度（25g/L），藥渣濃度（7g/L），尿素濃度（0.1g/L），初始pH（7），時(shí)間（48h）。然后，為了驗(yàn)證優(yōu)化半合成液體培養(yǎng)基的效果，分別取優(yōu)化前后的發(fā)酵MF1對(duì)湖水進(jìn)行處理，并測(cè)其絮凝活性和化學(xué)耗氧量，最后結(jié)果表明：MBF1的絮凝活性可達(dá)66.52%，對(duì)湖水化學(xué)需氧量降低了1.25 mg/L。

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