民族藥滇牡丹果皮中多糖的提取工藝研究

施蕊　趙能　夏箐　李彪　王娟

【摘 要】 目的：探索云貴高原和西藏高原特色民族植物滇牡丹果皮多糖的最佳提取工藝。方法：采用單因素實驗確定提取溶劑、提取方法和提取次數(shù)后，以料液比、提取溫度和提取時間為因素，分別設(shè)置三個水平設(shè)計L9（34）正交試驗優(yōu)化最佳提取工藝。結(jié)果：滇牡丹果皮中多糖提取的最佳溶劑為50%乙醇，提取的料液比為1∶40，提取方法為超聲輔助提取法，提取次數(shù)為3次，每次的提取時間為1.5h，提取溫度為40℃；在該工藝條件下，滇牡丹果皮多糖的提取量為（72.73±3.61）mg/g；料液比、提取溫度和提取時間對滇牡丹果皮多糖提取的貢獻率分別是89.256%、7.702%和1.512%。結(jié)論：料液比、提取溫度和提取時間顯著影響滇牡丹果皮多糖的提取，該工藝條件能夠有效提取滇牡丹果皮中的多糖。

【關(guān)鍵詞】 滇牡丹；果皮多糖；正交實驗；貢獻率

【中圖分類號】R284.2 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）04-0004-04

Abstract：Objective To study research on extraction technology of polysaccharide in Paeonia delavayi pericarp of national herbs distribute on Yunnan-guizhou plateau and the Tibetan plateau.[WTHZ]Method[WTBZ] Extraction solvent， method and time were determined by using single factor experiment， and process factors including ratio of material to solvent， extraction temperature， extraction times were selected and the optimum parameters were determined for extraction amount of polysaccharide.Result The optimized extraction process as follow： extraction solvent was 50% ethanol， ratio of material to solvent was 1∶40， extraction temperature was 40℃， extraction 3 times for 1.5 hours under ultrasonic assisted. The （72.73±3.61）mg/g polysaccharide was extracted from Paeonia delavayi pericarp under the optimized extraction process. The rate of contribution of ratio of material to solvent， extraction temperature and time were 89.256%，7.702%，1.512%. Conclusion The ratio of material to solvent， extraction temperature and time affected significantly extraction amount of polysaccharide，and the optimized extraction process could extract effectively polysaccharide in Paeonia delavayi pericarp of national herbs.

Keywords：Paeonia delavayi；Polysaccharide of Pericarp；Orthogonal Experiment；Rate of Contribution

滇牡丹（Paeonia delavayi Franch.）是芍藥科芍藥屬（Paeonia）牡丹組（Sect. Moutan）植物[1]，為我國特有的珍貴野生牡丹種質(zhì)資源[2]。滇牡丹（P. delavayi）分布于橫斷山區(qū)的東南邊緣，從昆明經(jīng)大理、麗江、中甸到西藏察隅，生態(tài)幅較廣[3-4]，是我國西南特有的珍惜瀕危植物，具有較高的觀賞價值和藥用價值。其籽、果皮含有價值很高的藥用成分，多糖有很好的藥理活性，比如機體免疫調(diào)節(jié)功能、降血糖活性、抗衰老作用。朱月等[5]研究表明，青春牡丹（Paeonia rockii ‘Qing Chun）多糖能夠清除羥自由基和超氧陰離子，具有抗氧化的作用；萬京華等[6]提取的牡丹皮（Paenoina Suffruticosa Andr.）多糖能夠增強吞噬細胞的功能，促進淋巴細胞轉(zhuǎn)化，增強小鼠免疫力。由此可見，牡丹多糖具有很高的藥用與保健價值，且多糖含量很豐富，但對于滇牡丹果皮多糖的測定、提取工藝及其生物活性方面的研究未見報道。研究采用正交實驗優(yōu)化滇牡丹果皮中多糖的提取工藝，為研究其多糖的生物活性奠定基礎(chǔ)，以期為滇牡丹的開發(fā)利用提供思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BS201S型萬分之一電子天平；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；LU10AT超聲波清洗器；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；N-1001EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械獨資工廠）；紫外分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司）。

1.2 材料 滇牡丹果皮，采于香格里拉；濃硫酸（分析純，天津市化學試劑三廠）；4%苯酚：稱取4.0g苯酚溶解后定溶到100ml。

2 方法

2.1 總多糖含量測定 多糖類化合物經(jīng)無機酸處理脫水產(chǎn)生糠醛或糠醛衍生物，生成物能與酚類化合物縮合生成有色物質(zhì)，溶液顏色會隨著溶液濃度的增加而加深。在490nm處有最大吸收，且吸收度與糖含量呈線性關(guān)系。精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖50mg置25ml容量瓶中，用蒸餾水定容，然后吸取次液1.25ml置于25ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，即得濃度為0.10mg/ml的葡萄糖溶液。精密量取葡萄糖標準液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2ml置10ml容量瓶中。分別加入5%苯酚溶液1ml，充分混合后，迅速加入5ml濃硫酸，再充分混合，置于45℃水浴30min后移至冰水浴中，放置30min后取出，在490nm處測其吸收度（A）。以濃度對吸收度做回歸，得回歸方程。

2.2 單因素實驗

2.2.1 提取方法對滇牡丹果皮多糖提量的影響 比較浸漬法、超聲波提取法、回流法對滇牡丹多糖含量的影響。浸漬法：精密稱取1g果皮于錐形瓶中，加入30ml甲醇，常溫浸提1h，抽濾定容；超聲波提取法：精密稱取1g果皮于錐形瓶中，加入30ml甲醇，常溫下超聲1h，超聲功率為50%，抽濾定容；回流法：精密稱取1g果皮于圓底燒瓶中，加入30ml甲醇，回流1h，抽濾定容，分別測定吸光度，每種方法測定3次。

2.2.2 提取溶劑對滇牡丹果皮多糖提量的影響 分別精密稱取滇牡丹果皮1g，置于干凈的50ml錐形瓶中，分別加入水、30%乙醇、50%乙醇、80%乙醇、甲醇為提取溶劑，料液比為1∶20（V∶V），超聲波提取30min，提取溫度為30℃，測定吸光度，計算提取的多糖含量，選取合適的提取溶劑。

2.2.3 提取次數(shù)對滇牡丹果皮多糖提量的影響 分別精密稱取滇牡丹果皮1g，置于干凈的50ml錐形瓶中，采用80%乙醇為提取溶劑，采用超聲波提取30min，料液比為1∶20（V∶V），分別提取2、3、4、5次，測定吸光度，計算提取的多糖含量，確定最佳提取次數(shù)。

2.2.4 料液比對滇牡丹果皮多糖提量的影響 分別精密稱取滇牡丹果皮1g，置于干凈的50ml錐形瓶中，采用80%乙醇為提取溶劑，采用超聲波提取30min，料液比為1∶10（V∶V）、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，分別提取3次，合并三次提取液，測定吸光度，計算多糖提取率，確定合適的料液比。

2.2.5 提取溫度對滇牡丹果皮多糖提量的影響 分別精密稱取滇牡丹果皮1g，置于干凈的50ml錐形瓶中，采用80%乙醇為提取溶劑，采用超聲波提取30min，料液比為1∶20（V∶V），提取溫度分別為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，分別提取3次，合并三次提取液，測定吸光度，計算多糖提取率，確定合適的提取溫度。

2.2.6 提取時間對滇牡丹果皮多糖提量的影響 分別精密稱取滇牡丹果皮1g，置于干凈的50ml錐形瓶中，采用80%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶20（V∶V），提取溫度分別為40℃，提取時間分別為0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，分別提取3次，合并三次提取液，測定吸光度，計算多糖提取率，確定合適的提取時間。

2.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進行方差和貢獻率分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 葡萄糖標準曲線 以葡萄糖濃度（C）為橫坐標，以吸光度（A）為縱坐標制圖，得線性回歸方程：Y=63.325x-0.0428（R2=0.9990 ），表明樣品在0.001～0.012mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。如圖1。

取提取液1ml于10ml容量瓶中用蒸餾水定容，然后再移取0.1ml置10ml容量瓶中，加入1ml 5%苯酚搖勻，再加入5ml濃硫酸，混勻，放置10min后用蒸餾水定容，搖勻，20min后測定吸光度，試劑為空白對照，利用回歸方程進行計算即可。果皮多糖提取率（K）按下式計算：K= m/M×100%，式中，m為果皮多糖質(zhì)量（mg）；M為果皮質(zhì)量（mg）。

3.2 單因素實驗結(jié)果 為選取的方法對滇牡丹果皮多糖進行提取，對比研究了浸漬法、超聲波提取法、回流法對滇牡丹果皮多糖的提取得率，并采用單因素實驗考察了選取方法中涉及的因素對滇牡丹果皮多糖提取得率的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2-a可知，超聲波提取法和回流提取法提取的滇牡丹果皮多糖含量沒有顯著性差異，且均顯著高于浸漬法得到的滇牡丹果皮多糖，但考慮到節(jié)省時間，因此選擇超聲波提取法為滇牡丹果皮多糖的提取方法。由圖2-b可知，以50%乙醇為溶劑時提取的滇牡丹果皮多糖顯著高于以水、30%乙醇、80%乙醇、甲醇為溶劑時的提取量，因此選擇50%乙醇為提取溶劑。由圖2-c可知，提取次數(shù)越多得到的滇牡丹果皮多糖含量越多，提取4次和提取5次后得到的滇牡丹多糖含量沒有顯著性差異，提取3次和提取4次得到的滇牡丹多糖含量有顯著性差異，但是沒有達到極顯著水平；因此，為節(jié)約時間成本，提取次數(shù)確定為3次。

由圖2-d可知，料液比對滇牡丹果皮多糖的提取率有顯著的影響，在實驗范圍內(nèi)，提取溶劑越多提取率越高，料液比1∶30、1∶40、1∶50時的提取率之間沒有顯著性差異，但它們分別顯著性高于料液比1∶10和1∶20時的提取率，因此，選擇1∶20、1∶30和1∶40為正交實驗中料液比的三個水平。由圖2-e可知，提取溫度對滇牡丹果皮多糖的提取率有顯著的影響，在實驗范圍內(nèi)，提取溫度越高提取率越高，40℃、50℃、60℃時的提取率之間沒有顯著性差異，但它們分別顯著性高于20℃和30℃時的提取率，因此，選擇30℃、40℃、50℃為正交實驗中提取溫度的三個水平。由圖2-f可知，提取時間對滇牡丹果皮多糖的提取率有顯著的影響，在實驗范圍內(nèi)，提取時間越長提取率越高，1.5h、2.0h、2.5h提取率之間沒有顯著性差異，但它們分別顯著性高于0.5h和1.0h的提取率，因此，選擇1.0h、1.5h和2.0h為正交實驗中提取時間的三個水平。

3.3 正交實驗設(shè)計及其結(jié)果 基于單因素實驗結(jié)果，以料液比、提取溫度和提取時間為因素，分別設(shè)置三個水平設(shè)計L9（34）正交試驗（見表1），確定超聲提取滇牡丹果皮多糖的最佳提取工藝參數(shù)，結(jié)果見表2。

由表2可知，料液比、提取溫度和提取時間均對滇牡丹果皮中多糖的提取有一定程度的影響。從K值可以看出，在實驗水平范圍內(nèi)，料液比和提取溫度不同的梯度水平均對多糖的提取量表現(xiàn)為正效應(yīng)影響，即提取液量越大提取量越大，提取溫度越高提取量越大。但是在實驗范圍內(nèi)，提取時間并沒有表現(xiàn)出和料液比、提取溫度相似的正效應(yīng)影響結(jié)果，而是表現(xiàn)為中間水平（1.5h）的提取量最大。從極差（R）可以看出，對滇牡丹果皮中多糖的提取量影響最大的是料液比，其次是提取溫度，影響最小的是提取時間。

為進一步分析各因素對實驗結(jié)果影響是否顯著及變異的解釋能力[7-9]，對表2的實驗結(jié)果進行了方差分析和貢獻率分析，結(jié)果見表3和表4。從表3可以看出，料液比、提取溫度和提取時間均對滇牡丹果皮多糖的提取有極顯著的影響（P<0.01），但是不能看出各因素的貢獻大小。與直觀分析的結(jié)果一致，從表4可以看出，料液比對滇牡丹皮中多糖的提取量影響最大，其貢獻率是89.256%；其次是提取溫度，其貢獻率是7.702%；影響最小的是提取時間，其貢獻率僅有1.512%。

綜上，滇牡丹果皮中多糖的最佳提取工藝為A3B3C2，即料液比為1∶40、提取溫度為50℃、提取時間為1.5h。優(yōu)化得到的條件和正價實驗中的第9組實驗一致，第9組實驗得到的滇牡丹果皮中多糖的提取量為（71.90±0.50）mg/g。

3.4 實驗驗證 在上述工藝條件下，滇牡丹果皮中提取的多糖含量為（72.73±3.61）mg/g，含量較正交表中最高得率的實驗小組（第9組，其提取量為（71.90±0.50）mg/g）提取的高，說明該工藝條件為滇牡丹果皮中總多糖的最優(yōu)提取工藝。

4 討論

研究表明，牡丹的種仁、花蕊、丹皮中含有大量的多糖，且不同部位的含量不同，不同的提取方法所得含量不同，不同的炮制方式也會多丹皮多糖的含量造成一定影響。諶志偉等[10]采用正交試驗優(yōu)化了牡丹（Paenoina suffruticosa Andr.）種仁中多糖的最佳工藝為：以料液比1∶20（w/v）混合后，95℃下提取120min，在此條件下牡丹種仁多糖的提取率為3.825%。周遠明等[11]通過正交試驗優(yōu)化了牡丹雄蕊中多糖的最佳工藝為：提取溫度90℃，料液比1∶15（g∶ml），提取3次，每次提取3h，劉帥[12]的研究結(jié)果與之一致，在此條件下牡丹雄蕊多糖提取率為3.06%。程迪等[13]通過正交實驗確定了牡丹皮多糖的最佳提取工藝：以液料比1∶80將物料混合后，50℃下提取20min，重復(fù)2次。程迪[13]、于孟琦等[14]采用苯酚-硫酸法測定了河南牡丹（Paenoina suffruticosa Andr.）皮的多糖含量，該方法測定了多糖濃度與吸光值之間有良好的線性關(guān)系。于孟琦等[14]研究不同炮制方法對牡丹皮多糖的影響，認為牡丹皮生品多糖含量為9.31%，酒制品為10.86%，炒黃制品為10.62%，炒焦制品為9.96%，炒炭制品為8.78%。與之稍有不同，熊艷等[15]研究認為不同炮制方式下，丹皮中多糖含量大小順序為生品>酒制品>炒黃品>炒焦品>炒炭品。

除丹皮、花蕊、種仁等部位中含有多糖外，滇牡丹果皮中也含有大量的多糖，并且提取的工藝條件也和前人的研究有所差異，最佳提取工藝是：提取溶劑為50%乙醇，提取時料液比為1∶40，超聲輔助下提取3次，每次提取時間為1.5h，提取溫度為50℃；該工藝條件下，滇牡丹果皮多糖的提取量為（72.73±3.61）mg/g。料液比、提取溫度和提取時間對滇牡丹果皮多糖提取的貢獻率分別是89.256%、7.702%和1.512%。

多糖有很好的藥理活性，如機體免疫調(diào)節(jié)功能、降血糖活性、抗衰老作用。高原特色的滇牡丹，其皮中豐富的多糖藥理活性如何，是今后研究云貴高原和青藏高原特色民族植物滇牡丹的重點方向之一。

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（收稿日期：2015.12.25）