HPLC波長(zhǎng)切換法測(cè)定復(fù)方紅根草片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量

唐德智

【摘 要】 目的： 建立HPLC波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定復(fù)方紅根草片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量的測(cè)定方法。方法：采用Waters SunFire C18 （4.6mm×250mm，5μm） 色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-水（52∶48）；流速：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：225nm（0～10min，穿心蓮內(nèi)酯），254nm（10～30min）。結(jié)果：穿心蓮內(nèi)酯在0.031～0.553μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9999，n=6），平均回收率為99.95%，RSD為1.5%（n=9）；脫水穿心蓮內(nèi)酯在0.049～0.887μg范圍內(nèi)性關(guān)系良好（r=0.9998，n=6），平均回收率為99.31%，RSD為1.1%（n=9）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 復(fù)方紅根草片；穿心蓮內(nèi)酯；脫水穿心蓮內(nèi)酯；波長(zhǎng)切換

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）04-0045-02

復(fù)方紅根草片是由金銀花、穿心蓮、紅根草、魚腥草、野菊花5味中藥制成的中藥制劑，具有清熱解毒的功效，臨床用于急性咽喉炎、扁桃體炎、腸炎、痢疾等。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)單，僅規(guī)定常規(guī)檢查，無(wú)定性定量檢測(cè)指標(biāo)，不能有效控制藥品質(zhì)量[1]。方中穿心蓮具有清熱解毒、涼血、消腫的功效，而穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯是穿心蓮藥材的主要有效成分?！吨袊?guó)藥典》2010年版一部將穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯作為穿心蓮藥材的含量測(cè)定質(zhì)量控制指標(biāo)[2]。研究參考有關(guān)文獻(xiàn) [3-5]，采用HPLC波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定復(fù)方紅根草中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量，方法準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，2489UV檢測(cè)器（美國(guó)沃特斯公司）；UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；S180H型超聲波清洗器（德國(guó)Elma公司）；XS205DU型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試藥 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：110797-200307）、脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：110854-201007）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；復(fù)方紅根草片（市售藥品，每片重0.31g，批號(hào)：130109、130307、130501、130904、131106）；甲醇、磷酸為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters SunFireTM C18 （4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（52∶48）；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～10min 225nm（穿心蓮內(nèi)酯），10～30min 254nm（脫水穿心蓮內(nèi)酯）；流速：1.0ml·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μl。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取干燥至恒重的穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品各適量，置同一50ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配制成1ml含穿心蓮內(nèi)酯61.4μg 、脫水穿心蓮內(nèi)酯98.6μg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物，混勻，取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，稱定重量，浸漬30min，超聲處理30min（功率300W，頻率40kHz），放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，微孔濾膜（0.45μm）濾過(guò)，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方比例及工藝制備缺穿心蓮藥材的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取供試品溶液、陰性樣品溶液和混合對(duì)照品溶液的稀釋液各10μl，在上述色譜條件下，注入液相色譜儀，記錄液相色譜圖，結(jié)果見圖1。由色譜圖可見，在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0ml分別置于10ml量瓶中，加甲醇至刻度，制成系列濃度混合對(duì)照品溶液，取上述對(duì)照品溶液各10μl注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進(jìn)樣量x（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。穿心蓮內(nèi)酯回歸方程：Y =2.45×106x+8.39×103，r =0.9999，脫水穿心蓮內(nèi)酯回歸方程：Y =1.72×106x+1.61×104，r=0.9998。結(jié)果表明穿心蓮內(nèi)酯在0.031～0.553μg、脫水穿心蓮內(nèi)酯在0.049～0.887μg范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下中間質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μl，記錄色譜峰峰面積，結(jié)果穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD分別為1.1%、0.7%。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號(hào)：130501），按上述色譜條件，分別于1、2、4、8、12、24h進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，結(jié)果表明穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD分別為1.2%、1.5%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批樣品（批號(hào)：130501）0.5g，平行稱取6份，按“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定，測(cè)得穿心蓮內(nèi)酯平均含量為1.48mg/g，RSD為1.5%，脫水穿心蓮內(nèi)酯平均含量為2.42mg/g，RSD為1.3%，。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批號(hào)樣品（批號(hào)：130501）約0.25g，平行稱取9份，置具塞錐形瓶中，分別加入穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的回收率分別為：99.95%（RSD=1.5%，n=9）；99.31%（RSD=1.1%，n=9）。結(jié)果表明，采用本方法測(cè)定復(fù)方紅根草片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量，方法回收率良好。

2.4 樣品測(cè)定 取5批復(fù)方紅根草片，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批平行制備3份，按上述色譜條件測(cè)定，每份樣品重復(fù)測(cè)定2次，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量，結(jié)果見表1。

3 討論

3.1 在供試品溶液制備過(guò)程中，分別考察了不同濃度乙醇、甲醇等溶劑進(jìn)行超聲提取，結(jié)果以50%甲醇超聲提取效率較好。同時(shí)比較超聲提取法與回流法，結(jié)果表明，超聲提取法提取的含量高于回流法提取的含量，故選擇超聲提取法制備供試品溶液。

3.2 取穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液，置UV-2550紫外可見分光光度計(jì)下于190～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果穿心蓮內(nèi)酯在225nm處有最大吸收，脫水穿心蓮內(nèi)酯在254nm處有最大吸收。為保證各成分在檢測(cè)波長(zhǎng)處有最大吸收，根據(jù)穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯在色譜圖中出現(xiàn)順序的不同，依次改變檢測(cè)波長(zhǎng)，來(lái)達(dá)到同時(shí)測(cè)定復(fù)方紅根草片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量的目的。

3.3 未見同時(shí)測(cè)定復(fù)方紅根草片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的報(bào)道，實(shí)驗(yàn)采用HPLC切換波長(zhǎng)的方法，同時(shí)測(cè)定復(fù)方紅根草片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2015.12.20）