12C6+輻射對(duì)黃瓜光合色素含量及光合基因表達(dá)的影響

蔡世娟 秦壘 曹天光

摘要 以自交系黃瓜18C-1為輻射試驗(yàn)材料，探究不同劑量12C6+輻射脅迫對(duì)黃瓜光合色素及光合基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，光合色素各組分Chla、Chlb、Cv含量在低劑量（60 Gy）輻射脅迫下響應(yīng)性下調(diào)，中、高劑量（80 ～120 Gy）輻射脅迫下響應(yīng)性上調(diào)，且中、高劑量下Chla含量均高于對(duì)照，Chlb含量均低于對(duì)照;光合基因rbcL、rbcS、rca、psbA表達(dá)量均受抑制，其中rbcL、rbcS、rca基因表達(dá)量隨輻射劑量增加呈“W”型響應(yīng)變化，psbA表達(dá)量呈“馬鞍”型響應(yīng)變化。綜上所述，12C6+輻射脅迫對(duì)黃瓜幼苗光合色素含量及光合基因表達(dá)水平產(chǎn)生影響。

關(guān)鍵詞 12C6+輻射脅迫;光合色素;光合基因;馬鞍型;W型

中圖分類號(hào) S-9 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）18-0059-04

Abstract The inbred cucumber 18C1 was used as radiation experiment material to explore the effects of different doses of 12C6+ radiation stress on the expression of photosynthetic pigment and photosynthetic genes in cucumber.The results showed that the Chla，chlb and Cv contents of photosynthetic pigment decreased in response to lowdose （60 Gy） radiation stress，and increased in response to medium and highdose （80-120 Gy） radiation stress，and the Chla contents were higher than those of the control，Chlb was lower than that of the control.The expression levels of rbcL，rbcS，rca and psbA genes were inhibited.The expression levels of rbcL，rbcS and rca genes showed a “W” response with the increase of radiation dose，and the expression levels of psbA showed a “saddle” response.In conclusion，12C6+ radiation stress had an effect on photosynthetic pigment contents and expression level of photosynthetic genes in cucumber seedlings.

Key words 12C6+ radiation stress;Photosynthetic pigments;Photosynthetic genes;Saddle;Type W

黃瓜（Cucumis sativus L）屬喜光、冷敏感植物，是我國設(shè)施農(nóng)業(yè)中產(chǎn)量最高的蔬菜品種之一，市場(chǎng)需求量大。光合作用是影響黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素，光合色素參與光能吸收、傳遞及光化學(xué)反應(yīng)，光系統(tǒng)是碳固定的主要場(chǎng)所，為植物生長發(fā)育及能量供應(yīng)提供動(dòng)力，因此光合色素各組分含量及光系統(tǒng)結(jié)構(gòu)顯著影響植物光合作用過程。

核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco酶）是調(diào)控光合碳同化的關(guān)鍵酶，其活性高低直接影響光合速率大小。Rubisco活化酶RCA由核基因rca編碼，能催化Rubisco酶達(dá)最大催化活性[1]。D1蛋白由質(zhì)體基因psbA編碼，是光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）中心蛋白之一，也是植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫的關(guān)鍵靶位。在脅迫環(huán)境中D1蛋白會(huì)迅速降解，生物體自身修復(fù)機(jī)制會(huì)合成新D1蛋白促進(jìn)PSⅡ功能修復(fù)，增強(qiáng)自身抗性，當(dāng)脅迫加劇時(shí)，D1蛋白降解速率超過自身修復(fù)速率，會(huì)損傷PSⅡ結(jié)構(gòu)并抑制其活性造成植物光合速率降低[2-3]，同時(shí)D1蛋白還介導(dǎo)初級(jí)電子供體和二級(jí)質(zhì)體醌受體，對(duì)脅迫環(huán)境也更敏感。因此在植物逆境脅迫敏感性研究上Rubisco酶、RCA及D1蛋白的含量、活性及編碼基因表達(dá)量均是重要研究指標(biāo)。

在以往研究中，干旱脅迫抑制外源甜菜堿psbA基因表達(dá)[4]。鹽脅迫明顯抑制水稻葉綠體內(nèi)psbA基因轉(zhuǎn)錄水平[5]。黃瓜在低溫弱光脅迫下rbcL、rbcS、rca表達(dá)量均顯著降低[6]。水稻在N+輻射脅迫下光合基因表達(dá)量發(fā)生變化[7]。De Micco等[8]研究發(fā)現(xiàn)12C6+輻射脅迫對(duì)電子傳遞載體、光合系統(tǒng)相關(guān)酶及補(bǔ)光天線復(fù)合物造成影響。但目前有關(guān)黃瓜在重離子12C6+輻射脅迫下Rubisco、RCA及D1蛋白編碼基因rbcL、rbcS、rca、psbA表達(dá)量研究鮮有報(bào)道，因此，筆者以自交系黃瓜種子18C-1為試驗(yàn)材料，通過探究不同劑量輻射對(duì)幼苗光合色素各組分含量、Chla/Chlb比值及光合基因表達(dá)量的影響，初步明確黃瓜幼苗光合特性對(duì)不同劑量12C6+輻射脅迫的響應(yīng)，并為后續(xù)12C6+輻射黃瓜的生物學(xué)效應(yīng)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 河北工業(yè)大學(xué)理學(xué)院生物物理研究所選育的黃瓜自交系種子18C-1。試劑：80%丙酮，TIANGEN植物總RNA提取試劑盒（DP432），反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa（RR037A），qPCR試劑盒TaKaRa（RR120Q）。儀器：HIRFL加速器，SPECORD250PLUS紫外可見分光光度計(jì)（UV-Vis spectrophotometer），CFX96 Touch。

1.2 試驗(yàn)方法 2019年3月9日在蘭州重離子加速器國家實(shí)驗(yàn)室HIRFL加速器上進(jìn)行輻射試驗(yàn)，將黃瓜種子單層固定到輻射器皿盤內(nèi)并用封口膜包裹，采用12C6+為誘變?cè)催M(jìn)行輻照試驗(yàn)（正常大氣壓和室溫）。輻射物理參數(shù)：能量80 MeV/u，傳能線密度30 keV/um，射程17 mm，劑量率60 Gy/min，劑量0、60、80、100、120 Gy。

1.3 光合色素測(cè)定 待幼苗生長24 d時(shí)用取樣器（d=7.84 mm）從幼苗第二片真葉同一葉位取樣后放置到（各組隨機(jī)選取3株）5 mL 80%丙酮溶液的棕色瓶中，用錫箔紙包裹置黑暗處浸提，期間多次振蕩，待樣品變白，在紫外分光光度計(jì)下測(cè)定645、663 nm處OD值，按Arnon公式計(jì)算光合色素各組分含量。

1.4 熒光定量PCR 待幼苗生長24 d時(shí)從各組隨機(jī)采摘3株幼苗葉片，ddH2O沖洗干凈，提取樣本總RNA。紫外分光光度計(jì)和1%的瓊脂瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA濃度和質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。熒光定量PCR測(cè)定目的基因相對(duì)表達(dá)量。qPCR反應(yīng)體系共25 μL，TB Green Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2×） ?12.5 μL，正向引物（10 μmol/L） ?0.5 μL，反向引物（10 μmol/L） ?0.5 μL，DNA模板+滅菌水 11.5 μL。反應(yīng)程序：Step1：95 ℃ ?30 s;Step2：PCR反應(yīng)（40 Cycles）;95 ?℃ ?5 s;60 ℃ ?30 s;Step3：Melt Curve。供試引物由上海生物工程有限公司合成，純化方式為HPLC，引物序列見表1。

1.5 數(shù)據(jù)處理 Arnon公式：Chl a=12.7OD663-2.69OD645;Chl b=22.9OD645-4.86OD663;CV（μg/mL）= Chl a + Chl b。以18S rRNA為內(nèi)參引物，采用△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量：目的基因相對(duì)表達(dá)量= 2-△△Ct，△△Ct=△Ct Gene - △Ct Control，其中△Ct Gene =（目的基因Ct值）-（同一樣本內(nèi)參基因Ct值），△Ct Control =（對(duì)照組目的基因Ct值）-（內(nèi)參基因Ct值）;用Origin 9繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻射對(duì)光合色素各組分含量的影響

光合色素是植物光合作用的基礎(chǔ)。由圖1可知，不同劑量重離子輻射下Chla較對(duì)照依次變化-12.71%、0.88%、7.62%、7.60%;Chlb較對(duì)照依次變化-36.76%、-25.27%、-16.27%、-14.21%，表現(xiàn)為明顯的輻射抑制作用;Cv較對(duì)照依次變化-18.92%、-5.87%、1.45%、1.97%;Chla/Chlb較對(duì)照依次變化38.03%、34.99%、28.52%、25.42%。

光合色素各組分含量均表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，隨輻射劑量增加Chla、Chlb、Cv含量呈先降后升變化趨勢(shì);Chla/Chlb則呈先升后降變化趨勢(shì)。

2.2 輻射對(duì)光合基因表達(dá)量的影響

在高等植物中Rubisco酶由大亞基（rbcL基因編碼）和小亞基（rbcS基因編碼）組成，大亞基起催化功能，小亞基遠(yuǎn)離活性中心維持并穩(wěn)定酶活化構(gòu)象[9]。Rubisco酶催化效率很低，其分子伴侶RCA（rca基因編碼）能催化Rubisco達(dá)最大催化活性。由圖2可知，不同劑量重離子輻射下rbcL基因相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照依次變化-53.81%、-35.20%、-57.13%、-37.72%，rbcS基因相對(duì)表達(dá)量依次變化-52.21%、-35.53%、-68.95%、-50.68%，rca基因相對(duì)表達(dá)量依次變化-40.92%、-20.89%、-35.66%、-9.77%，即輻射顯著抑制rbcL、rbcS、rca的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，此外，隨輻射劑量增加rbcL、rbcS、rca基因相對(duì)表達(dá)量均呈“W”型變化趨勢(shì)，表現(xiàn)出規(guī)律性的劑量效應(yīng)關(guān)系。

D1蛋白由psbA基因編碼是光合系統(tǒng)中最重要的結(jié)構(gòu)、功能蛋白之一，其含量是表征植物抗逆能力的重要指標(biāo)[10]。不同劑量重離子輻射下psbA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照依次變化-48.31%、-8.08%、-34.99%、-35.66%，即輻射抑制psbA表達(dá)量，其中60 Gy輻射下psbA相對(duì)表達(dá)量最低為0.516 86。此外隨輻射劑量增加psbA基因相對(duì)表達(dá)量呈先降后升再降的“馬鞍”型變化趨勢(shì)。

3 結(jié)論與討論

研究表明，重離子輻射破壞生物大分子DNA構(gòu)象、構(gòu)型及細(xì)胞器結(jié)構(gòu)（類囊體擴(kuò)張，基粒片層數(shù)量減少）并抑制光合色素及相關(guān)蛋白合成[11-15]，同時(shí)產(chǎn)生大量自由基和活性氧，降解D1蛋白造成光系統(tǒng)結(jié)構(gòu)損傷[16-17]，從而影響植物光合作用。

在植物生長過程中，光合色素是吸收、傳遞、轉(zhuǎn)化光能的基礎(chǔ)，而葉綠素作為光合作用中主要色素，其各組分含量、Chla/Chlb是表征植物光合組織生理狀況的重要指標(biāo)，顯著影響植物光合作用，因此一直是植物生理學(xué)研究的重點(diǎn)工作之一。此外，植物葉色變化在一定程度上反映葉綠素降解狀況，并在一定范圍內(nèi)與植物光合作用呈正相關(guān)[18]，對(duì)光合基因研究也發(fā)現(xiàn)rbcS、rbcL、rca僅在綠色組織中表達(dá)[19-20]，而根、黃化苗中均不表達(dá)[21]，即植物葉色變化在一定程度上影響光合色素含量及光合基因表達(dá)。輻射黃瓜田間試驗(yàn)表明，輻射組出現(xiàn)不等數(shù)量、不同程度的黃化苗、白斑苗及葉色（深綠、淺綠）變異苗，因此，從輻射黃瓜幼苗宏觀生物學(xué)性狀即可推斷12C6+輻射對(duì)幼苗光合色素含量及光合基因表達(dá)量產(chǎn)生影響。

該研究中，低劑量（60 Gy）輻射下，Chla、Chlb、Cv含量均低于對(duì)照，即低劑量輻射對(duì)光合色素各組分含量有抑制作用，減弱幼苗光合作用和抗逆性，中、高劑量（80～120 Gy）下，Chla含量均高于對(duì)照，Chlb含量低于對(duì)照但呈上升趨勢(shì)，即中、高劑量輻射增強(qiáng)幼苗光合作用和抗逆性，該結(jié)果與強(qiáng)繼業(yè)等[22]對(duì)球根海棠（根）、仙客來研究結(jié)果相一致。與馮亮英[23]對(duì)甜高粱研究存在異同，相同之處：Chla在低劑量輻射下（40 Gy）低于對(duì)照，在中、高劑量輻射下表現(xiàn)為促進(jìn)作用，Chlb含量在整個(gè)劑量范圍內(nèi)均低于對(duì)照，表現(xiàn)為明顯的輻射抑制作用;差異之處：在相同劑量范圍內(nèi)（0～120 Gy）Chla含量呈先降后升再降的趨勢(shì)，在40 Gy有最低值，80 Gy有最高值，100、120 Gy又明顯下降，即變化趨勢(shì)有所差異。與薛林貴等[24]、李雪虎等[25]研究結(jié)果不同。Chla/Chlb變化趨勢(shì)與Chla、Chlb、Cv趨勢(shì)相反，60 Gy輻射下有最高值，且各輻射組均高于對(duì)照。Chla/Chlb表征植物PSⅡ內(nèi)聚光復(fù)合體LHCII在所有含葉綠素的結(jié)構(gòu)中所占比例大小，此值與LHCII含量呈負(fù)相關(guān)[26]，說明中、高劑量較低劑量能促進(jìn)幼苗葉片中LHCII含量增加，確保植物能夠捕獲更多光能用于光合作用。

輻射脅迫抑制rbcL、rbcS、rca基因相對(duì)表達(dá)量，與Jiang等[27]研究黃瓜對(duì)低溫、弱光脅迫響應(yīng)結(jié)果相一致。此外輻射對(duì)rbcL、rbcS基因表達(dá)量抑制程度顯著高于rca，即rbcL、rbcS較rca對(duì)脅迫更敏感，此結(jié)果與唐如航等[20]的研究結(jié)果相悖。psbA基因表達(dá)量顯示，80 Gy輻射下，psbA基因表達(dá)量上調(diào)以提升幼苗抗逆能力，100、120 Gy輻射下psbA表達(dá)量下調(diào)，但仍高于60 Gy。

rbcL、rbcS、rca、psbA基因表達(dá)量均表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。rbcL、rbcS、rca表現(xiàn)出先降后升再降再升的“W”型變化趨勢(shì);psbA表現(xiàn)出先降后升再降的“馬鞍”型變化趨勢(shì)，這種變化趨勢(shì)與李多芳等[28]、顧建中等[29]提出的輻射損傷修復(fù)模型相一致。原因可能是低劑量輻射會(huì)抑制光合基因表達(dá)并對(duì)光系統(tǒng)結(jié)構(gòu)造成損傷，表現(xiàn)在60 Gy輻射下rbcL、rbcS、rca、psbA表達(dá)量明顯降低，但植物在進(jìn)化過程中形成自身防御系統(tǒng)以應(yīng)對(duì)逆境脅迫，如類囊體內(nèi)可能存在破壞修復(fù)系統(tǒng)、活性氧清理機(jī)制等，其中新D1蛋白的合成與激活則會(huì)及時(shí)修復(fù)PSⅡ損傷;當(dāng)輻射劑量達(dá)某一閾值時(shí)，則激發(fā)出植物自身防御系統(tǒng)促進(jìn)光合蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，表現(xiàn)80 Gy輻射下rbcL、rbcS、rca、psbA基因表達(dá)量上調(diào)，促進(jìn)新D1蛋白合成并組裝到降解D1蛋白反應(yīng)中心，隨后激活行使其功能[30]，同時(shí)也促進(jìn)Rubisco酶及活化酶RCA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)以提升黃瓜幼苗的抗逆性，這種損傷修復(fù)機(jī)制是植物抵抗逆境脅迫的關(guān)鍵;當(dāng)輻射劑量繼續(xù)增大時(shí)，植物體受損嚴(yán)重遠(yuǎn)超過自身修復(fù)能力，基因表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，表現(xiàn)在100、120 Gy輻射下psbA基因表達(dá)量下調(diào)，預(yù)測(cè)當(dāng)輻射劑量繼續(xù)增大時(shí)會(huì)造成致死損傷，但rbcL、rbcS、rca基因相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)“W”型劑量效應(yīng)關(guān)系，與psbA基因表達(dá)量的“馬鞍”型變化趨勢(shì)有所差異，即rbcL、rbcS、rca在120 Gy輻射下表達(dá)量有上調(diào)變化，原因可能是高劑量輻射（120 Gy）脅迫下，psbA基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，黃瓜幼苗通過上調(diào)rbcL、rbcS、rca表達(dá)量來提高幼苗逆境脅迫適應(yīng)性。

綜上所述，重離子12C6+輻射對(duì)黃瓜幼苗光合色素及光合基因表達(dá)的影響與以往研究結(jié)果存在異同之處，原因可能是輻射離子種類、劑量、能量、植物體自身敏感性及生長環(huán)境等諸多因素綜合影響。此外，同一輻射劑量下不同基因表達(dá)量有上調(diào)變化，有下調(diào)變化，光合色素各組分含量、Chla/Chlb及rbcL、rbcS、rca、psbA基因表達(dá)水平的劑量效應(yīng)關(guān)系也呈現(xiàn)出多種變化趨勢(shì)，原因可能是調(diào)控植物光合作用的色素、基因數(shù)量眾多，植物在適應(yīng)脅迫環(huán)境過程中會(huì)統(tǒng)籌多方調(diào)控手段，以使調(diào)控結(jié)果最優(yōu)化，減少植物所受損傷，同時(shí)也表明光合色素及光合基因在應(yīng)對(duì)輻射脅迫時(shí)響應(yīng)的復(fù)雜性。

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