母犬發(fā)情期生殖激素測定及其意義

遼寧省阜新市現(xiàn)代農業(yè)發(fā)展服務中心，遼寧阜新123000

母犬在發(fā)情期的生殖激素水平會有一定規(guī)律的變化，本試驗通過對發(fā)情期母犬的連續(xù)監(jiān)測，采集靜脈血，分別采用人促黃體生成激素放射免疫分析藥盒的方法、人促濾泡激素放射免疫分析藥盒的方法和孕酮放射免疫分析藥盒的方法對促黃體生成素（LH）、促卵泡素（FSH）和孕酮（P4）3種激素進行檢測，從檢查數(shù)據(jù)中總結、發(fā)現(xiàn)規(guī)律，可以進一步來確定排卵時間，從而能夠更好地服務于犬的飼養(yǎng)和繁殖，為犬人工受精和胚胎移植奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與血樣來源

本試驗于2017年9月10日-12月30日進行，血樣來自沈陽農業(yè)大學動物醫(yī)院試驗犬，犬群28只，對其中的15只發(fā)情母犬隨機抽取6只采血。

1.2 試劑和診斷試劑盒

1）肝素鈉：AR，中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑公司，批號：980805；

2）氯化鈉：AR，沈陽試劑廠，批號：060120；

3）蒸餾水：沈陽農業(yè)大學動物醫(yī)院相關試驗室；

4）LH放免藥盒：天津九鼎醫(yī)學生物制品有限公司，批號：S10950178；

5）FSH放免藥盒：天津九鼎醫(yī)學生物制品有限公司，批號：S10950177；

6）Prog放免藥盒：天津九鼎醫(yī)學生物制品有限公司，批號：S10950183。

1.3 試驗器械

無菌注射器（5 mL）、輸液器（帶針）、帶蓋塑料離心管（1.5、5 mL）、止血帶、脫脂棉、記號筆、天平、微量移液器（量程分別是：5～50、20～200、50～1 000 μmL）、小燒杯、100 mL 定量瓶、藥匙、玻璃紙、量筒（10、50、100、1 000 mL）、膠帶、玻璃棒、試管刷等。

1.4 試驗方法與步驟

1）促黃體生成激素的測定（LH放免藥盒法）[1-2]。

①藥盒組分。標準品：7瓶，1 mL/瓶，0、5、10、20、40、100、200 U/mL；質控血清：1 mL/瓶，2瓶；抗體：10/20 mL/瓶；標記物：10/20 mL，1瓶；分離劑：25/50 mL/瓶。分析藥盒中試劑均應2～8℃保存，有效期內穩(wěn)定。

②步驟?？焖贆z測法，采用血漿標本，經標準靜脈穿刺術采集全血，盡快分離血漿，按表1進行操作。

2）促卵泡素的測定（FSH放免藥盒法）[2]。

①藥盒組分。質控血清：1 mL/瓶，2瓶；抗體：10/20 mL/瓶；標記物：10/20 mL/瓶；分離劑：25/50 mL/瓶。分析藥盒中試劑均應2～8℃保存，有效期內穩(wěn)定。

②步驟?？焖俜ǎ捎醚獫{標本。

3）孕酮的測定（Prog放免藥盒法）。

①藥盒組分。每1 mL 標記物所含總放射性＜5.0 KBQ。分離劑：1瓶×50/100 mL，用前搖勻。分析藥盒中試劑均應2～8℃保存，有效期內穩(wěn)定。

②步驟。采用血漿標本，經標準靜脈穿刺術采集全血，盡快分離血清，按表2進行操作。

2 結果與分析

2.1 促黃體生成激素

從表3和圖1可以看出，若僅以發(fā)情前期、發(fā)情期LH的數(shù)據(jù)去推斷母犬的排卵情況是很難的，因其變動范圍較大。母犬在發(fā)情前期和發(fā)情期LH呈脈沖式分泌，所以其準確峰值很難捕捉到。

2.2 促卵泡激素

從表4可以看出，不同個體血漿中FSH水平差別較大，范圍較寬。

2.3 孕 酮

通過以上數(shù)據(jù)觀察孕酮值在發(fā)情前即將結束時（第1天）開始升高，然后在發(fā)情期（13～24 d）孕酮值迅速升高，并且出現(xiàn)峰值。孕酮值最大的特點是在發(fā)情期就開始升高，到排卵前后繼續(xù)升高。綜上所述，孕酮的含量變化是比較穩(wěn)定且有規(guī)律，而FSH、LH的測定值很不穩(wěn)定，其規(guī)律不易把握（表5）。

3 討 論

3.1 促黃體生成激素的濃度及測定意義

確切地說，由于雌孕激素的下降，腦垂體分泌FSH（卵泡刺激素）的抑制解除，F(xiàn)SH 開始上升，促使一組初級卵泡發(fā)育，新一批卵泡所產生的雌激素逐漸上升，子宮內膜逐漸增厚，此時LH水平在卵泡期逐漸緩慢升高[3]。

表1 LH放免藥盒法操作表

表2 孕酮放免藥盒法操作表

表3 LH測定值 mg/mL

3.2 促卵泡激素的濃度及測定意義

FSH 波動與卵泡生長波一致，其波動的大小與卵泡發(fā)育的數(shù)量及大小有關[4]。FSH在卵泡期隨著卵泡的發(fā)育而分泌量逐漸增多，發(fā)情時達到峰值，排卵后降至低水平，然后又呈現(xiàn)較平穩(wěn)的脈沖式分泌。但在發(fā)情周期中，血漿FSH水平升高比LH 早，可能是因為在黃體期GnRH 分泌頻率和量都相應減少。這種持續(xù)而又緩慢的GnRH的刺激有利于FSH的分泌，所以在黃體的晚期和卵泡的早期FSH水平即升高[5]。

3.3 FSH與LH含量的比例及其意義

正常情況下，F(xiàn)SH與LH在血液中達一定比例時引起排卵，可以較好評估卵巢儲備、卵巢反應性以及排卵能力[6]。由于試驗經費等原因，沒有進行深入的對比研究。這部分是筆者個人認為需要獸醫(yī)工作者加強研究總結的地方，因為我們對犬正常發(fā)情期各段內FSH/LH 沒有測定和記錄，所以很難說明其深遠意義。

3.4 孕酮的濃度及測定意義

通過測定血漿中孕酮的水平，可以判斷卵巢上是否有黃體，從而可以初步判斷母犬的繁殖狀態(tài)。建議2～4 d后再做1次樣品檢測，來確保孕酮含量在持續(xù)上升以及有排卵。排卵后黃體形成，分泌多量孕酮（黃體酮），比排卵前的孕酮明顯增加，一般認為≥5 mg/mL時為排卵。

圖1 母犬發(fā)情期促黃體生成素含量變化曲線

表4 FSH測定值mg/mL

表5 P4測定值 mg/mL

4 結 論

綜上所述，孕酮的含量變化比較穩(wěn)定且有規(guī)律，而FSH、LH的測定值很不穩(wěn)定，其規(guī)律不易把握。這可能是與FSH、LH的分泌方式有關（其脈沖式分泌），另外FSH和LH的測定要求比較嚴格，其保存方式也可能影響其數(shù)值。同時，對于同一品種的母犬來說，F(xiàn)SH、LH的差異很大，把握其規(guī)律從而更好地服務于犬的飼養(yǎng)和繁殖，同時可以指導我們進一步來確定排卵時間，為犬的人工受精和胚胎移植奠定基礎。