延經(jīng)丸對去勢模型大鼠腎上腺皮質(zhì)中Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

趙粉琴,李春瑤,劉曉莉,茍亞嬌,胡志霞,徐世倩,袁愛倩,張文靜

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 73000)

圍絕經(jīng)期出現(xiàn)潮熱出汗，記憶力下降，煩躁易怒，心血管疾病以及情感障礙(抑郁或焦慮)等癥狀。目前普遍認為[1-2]，該癥狀的主因是女性卵巢功能衰退，雌激素水平低下，對下丘腦-垂體的負反饋抑制作用降低，繼發(fā)垂體功能一時亢進，引起下丘腦-垂體-卵巢軸(HPO軸)與下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)功能紊亂有關(guān)。

中醫(yī)學(xué)認為腎腦相關(guān)，《素問·六節(jié)藏象論》《素問·五臟生成》《素問·陰陽應(yīng)象大論》等篇章論述的“腎精生髓，髓通于腦”從髓的角度來說明腎與腦的關(guān)系[3]。近年來大多數(shù)學(xué)者對于腎腦相關(guān)理論的探討多由腎與腦血管、腦神經(jīng)疾病入手，如補腎中藥對延緩腦組織衰老的研究、腦卒中與腎功能損害的研究等[4-6]。所以圍絕經(jīng)期諸癥的出現(xiàn)腎虛為本，精虧血虛，不能濡養(yǎng)臟腑，出現(xiàn)一系列功能紊亂征象。

延經(jīng)丸是甘肅省名老中醫(yī)牟惠琴教授的經(jīng)驗方，由生地黃、熟地黃、菟絲子、紫河車、阿膠、枸杞子、白術(shù)、巴戟天、鹿角霜、山藥等藥物組成，具有補腎健脾功效。前期的研究表明[7-9]延經(jīng)丸能明顯改善卵巢功能衰退后激素水平變化，提高女性體內(nèi)雌激素的分泌，同時可以升高血清降鈣素水平，達到改善圍絕經(jīng)期大鼠骨質(zhì)疏松。說明補腎中藥對HPO具有明顯調(diào)控作用，具有改善女性卵巢子宮等性腺器官的功能，促進卵泡發(fā)育以及維持內(nèi)分泌功能。但對HPA軸的調(diào)控作用研究較少，本研究通過實驗進一步探討延經(jīng)丸能否改善腎上腺組織功能亢進，平衡激素分泌紊亂狀態(tài)，達到調(diào)理女性圍絕經(jīng)期綜合征的主要作用。

1 材料和方法

1.1 動物模型分組及給藥

選用雌性SD大鼠，6月齡60只，體質(zhì)量(200±20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SYXK(甘)2004-0006。隨機分成實驗組(50只)和正常組(10只)，實驗組采用雙側(cè)卵巢切除造模，術(shù)后第6天開始逐只每天進行陰道脫落細胞涂片，連續(xù)觀察3個動情期(15 d)，涂片呈現(xiàn)為動情周期紊亂、動情間期延長，為去勢大鼠。造模成功后大鼠再次隨機分為5組，每組10只：模型組，安定組，補佳樂組，延經(jīng)丸高劑量組，延經(jīng)丸低劑量組。補佳樂片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，批號：國藥準字J20130009)，成人用量：每日1 mg，換算成大鼠為6.3 mg/kg，補佳樂用蒸餾水配成0.63 mg/mL溶液。地西泮，成人用量：每日2.5 mg，換算成大鼠為15.75 mg/kg，用蒸餾水配成1.575 mg/mL溶液；延經(jīng)丸，成人用量：每天9 g，配成50.50 g/mL溶液；大鼠藥劑量分別為25.25 g/200 g(5倍)、101 g/200 g(20倍)。各組按0.5～2 mL/200 g體質(zhì)量，灌服相應(yīng)藥液，連續(xù)42 d(6個周期)。

1.2 標本采集

最后一次灌服藥物24 h后，用10%水合氯醛腹腔麻醉，采用眼內(nèi)眥靜脈叢采血法采血，每管收集1.5 mL血樣于 EDTA 抗凝管中。離心(1 200 r/min)10 min后，吸取上清置-80 ℃保存。后處死，剖取腎上腺組織，固定，包埋，切片，染色。

1.3 檢測指標

1.3.1 大鼠活動次數(shù)

用動物紅外自主活動測試儀，記錄透明飼養(yǎng)籠檢測大鼠自由活動時間，實驗選擇的采樣統(tǒng)計間隔時間為5 min，連續(xù)記錄動物自主活動量，結(jié)果以1 h自主活動累積量進行表示。抑制率計算：抑制率=(正常組活動量-監(jiān)測組活動量)/正常組活動量×%。

1.3.2 檢測大鼠血清ACTH、CORT

應(yīng)用ELISA方法在VERSA max酶標儀上測定血清內(nèi)ACTH、COR 的含量，按照試劑說明書操作。

1.3.3 免疫組化SP法檢測腎上腺組織的Bax、Bcl-2表達

操作程序按SP試劑盒說明書進行。分別計數(shù)腎上腺皮質(zhì)組陽性細胞數(shù)。按陽性細胞所占百分比及染色強度兩者結(jié)合分析判斷。陽性細胞所占百分比，即陽性細胞數(shù)≤25%為(+)，25%～50%為(++),>50%為(+++)，無陽性細胞(-)；染色強度：淺黃色為(+)，棕黃色(+ +)，棕褐色為(+++)，未著色細胞為(-)。每張切片至少觀察3個視野。強陽性率=+ +總數(shù)和+++表達總數(shù)之和。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠自主活動和抑制率比較

去勢后大鼠煩躁，自主活動明顯增加，與正常對照組、安定組、補佳樂組和延經(jīng)丸高、低劑量組比較大鼠活動次數(shù)明顯增加，而延經(jīng)丸能明顯抑制，大鼠活動減少(P<0.01)，尤其是延經(jīng)丸高劑量組抑制率明顯(P<0.01)。見表1、圖1。

表1 各組大鼠自主活動量和抑制率比較

注：與模型組比較，**P<0.01；與正常對照組比較,△P<0.01

2.2 各組大鼠入睡率和睡眠潛伏期比較

安定組、延經(jīng)丸高、低劑量組入睡率明顯提高，與正常對照組、模型組之間比較都有明顯差異(P<0.01)，睡眠潛伏期延經(jīng)丸高劑量與模型組、正常對照組、安定組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2、圖2。

注：與模型組比較，**P<0.01；與安定組比較，▲P<0.05；與正常對照組比較，△P<0.01

表2 各組大鼠睡眠率和睡眠潛伏期比較

2.3 各組大鼠皮質(zhì)醇水平比較

各組大鼠血清皮質(zhì)醇含量比較，模型組大鼠血清ACTH和CORT含量增加，尤其是血清ACTH含量增加較為顯著，與正常組、補佳樂組、延經(jīng)丸高、低劑量組之間比較都有明顯差異(P<0.01)，而血清CORT含量與正常組、延經(jīng)丸高、低劑量組之間比較有差異(P<0.01)，結(jié)果見表3、圖3。

注：與模型組比較，**P<0.01

表3 各組大鼠血清皮質(zhì)醇檢測結(jié)果比較

2.4 各組大鼠腎上腺組織結(jié)構(gòu)比較

青年組大鼠腎上腺束狀帶與球狀帶之間的界限清晰，細胞形狀規(guī)則，排列有序，模型組大鼠的腎上腺束狀帶和球狀帶界限均出現(xiàn)明顯的模糊化，可分泌CORT的束狀帶細胞數(shù)量明顯增多，體積變大呈空泡狀，可能正處于功能亢進狀態(tài)。補佳樂組和延經(jīng)丸高劑量組大鼠腎上腺束狀帶與球狀帶之間的界限逐漸清晰，細胞形狀規(guī)則，延經(jīng)丸低劑量組和模型組之間差異不大，中間空泡狀組織增多，血運豐富。見圖4。

圖4 各組大鼠腎上腺組織結(jié)構(gòu)

2.5 各組大鼠腎上腺皮質(zhì)Bax和Bcl-2陽性表達的比較

見表4、圖5、圖6。

圖6 延經(jīng)丸對大鼠腎上腺皮質(zhì)Bax陽性表達的影響(400×)

表4 各組大鼠腎上腺皮質(zhì)Bax和Bcl-2陽性表達的比較

3 討論

圍絕經(jīng)期婦女卵巢功能衰竭，雌激素水平下降，導(dǎo)致調(diào)節(jié)內(nèi)分泌的H-P-O神經(jīng)內(nèi)分泌軸紊亂，機體會產(chǎn)生應(yīng)激性保護，引起 HPA軸興奮，刺激腎上腺分泌與釋放大量糖皮質(zhì)激素[10](CRH、CORT，CORT 是 HPA 軸重要激素之一可調(diào)節(jié)人體的代謝、認知功能和情緒等[11])。HPA軸功能亢進，反過來抑制HPO，抑制雌激素分泌，導(dǎo)致植物神經(jīng)功能紊亂，出現(xiàn)一系列的潮熱、出汗、失眠、抑郁甚至焦慮等情緒障礙，且糖皮質(zhì)激素增高的程度與該病的發(fā)病程度密切相關(guān)[12]。也有研究表明[13-15]，使用雌激素可以通過抑制ACTH與CORT而起到抗抑郁的作用，進一步說明絕經(jīng)期綜合征(尤其是情感障礙)與圍絕經(jīng)期雌激素水平的低下，HPA軸功能亢進有關(guān)[16-17]。

中醫(yī)學(xué)認為婦女七七之年，腎氣衰，天癸竭，精血虛，氣血弱，沖任不顧，臟腑功能異常，腎陰陽失調(diào)。腎主藏精為先天之本，精化氣，氣生精，精生血，精血同源相互滋生。絕經(jīng)期腎氣虛衰，腎之精血虛損，即天癸竭，傷及五臟六腑。

延經(jīng)丸，主要由生地黃、熟地黃、菟絲子、紫河車、阿膠、枸杞子、白術(shù)、巴戟天、鹿角霜、山藥等藥物組成。以生地黃、熟地黃、鹿角霜、枸杞子、巴戟天、菟絲子、紫河車補腎壯陽，益精生髓，陰陽雙補，符合腎藏精，寓水火與一臟的理論；用枸杞子、阿膠補養(yǎng)肝血；白術(shù)、山藥健脾益氣，以補后天之氣，提高人體消化吸收的能力。延經(jīng)丸組方從多臟腑補益調(diào)節(jié)著手，以補腎陰為主，陰陽并補，健脾益氣為輔，先天與后天相輔相成，體現(xiàn)了中醫(yī)的整體觀念的思想，根據(jù)肝腎同源，精血同源的理論，腎精充足，肝血有藏，髓海得養(yǎng)，記憶力恢復(fù)，情緒平緩。

本研究表明延經(jīng)丸可以改善卵巢功能下降后刺激引起的腎上腺功能亢進狀態(tài)，大鼠自主活動減少，睡眠時間延長，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，同時去勢大鼠血清ACTH和CORT明顯增高，說明存在HPA 軸亢奮狀態(tài)，而延經(jīng)丸和補佳樂組能抑制糖皮質(zhì)激素的水平,與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。通過組織病理學(xué)表現(xiàn)分析去勢大鼠腎上腺束狀帶和球狀帶界限不清晰,束狀帶細胞數(shù)量明顯增多,呈空泡狀,表面以上組織均存在明顯損傷，腎上腺皮質(zhì)層中Bax強表達，bcl-2弱表達，延經(jīng)丸和補佳樂組能抑制腎上腺皮質(zhì)層Bax的表達，提高bcl-2的表達，各組之間比較有差異。進一步說明延經(jīng)丸能夠下調(diào)異常增高的糖皮質(zhì)激素，大大改善平衡和改善機體應(yīng)激狀態(tài)。機體產(chǎn)生應(yīng)激性保護，引起HPA 軸亢奮，而興奮的 HPA 軸抑制HPO軸的功能，雌激素和延經(jīng)丸都可以抑制亢奮的HPA軸，尤其以延經(jīng)丸高劑量組作用最顯著。

當 HPA 軸長期處于亢進狀態(tài)，可導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌異常和情感異常行為的發(fā)生[18]。所以針對圍絕經(jīng)期出現(xiàn)腎上腺亢進引起的煩躁易怒，以及情感障礙的患者，在中醫(yī)治療上，可以通過“補益肝腎”的治療原則，來調(diào)節(jié)HPO軸與HPA軸之間的功能紊亂，從而緩解圍絕經(jīng)期出現(xiàn)一系列綜合征。