黑木耳寡糖在嗜酸乳桿菌微膠囊中的作用

何榮軍，劉高丹，項群然，孫培龍

(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

益生菌可以調(diào)節(jié)腸道菌群，給宿主的健康帶來益處，但其在加工儲藏和通過胃腸道時活菌數(shù)會大幅度減少，很難達到國際乳聯(lián)標(biāo)準(zhǔn)化委員會規(guī)定的益生菌產(chǎn)品中活菌數(shù)要≥106CFU/mL(g)的規(guī)定[1-2]。因此，在脅迫環(huán)境中如何提高菌體抗性已經(jīng)成為近年來研究的熱點[3]。益生菌微囊化技術(shù)是將益生菌包裹在微小且封閉的膠囊中，使微膠囊既能抵御胃液的刺激，又能在腸道有效釋放，溫和且穩(wěn)定[4-5]。

黑木耳屬擔(dān)子菌綱，木耳目，木耳科，含有多糖和低聚糖等功效成分，具有降血脂、降血糖、抗腫瘤、延緩衰老等作用[6-7]。大量研究表明，以低聚糖類益生元(如菊粉、低聚半乳糖和低聚果糖等)[8]作為壁材添加到益生菌微膠囊中，其在體外模擬胃腸液和貯藏性能實驗中都表現(xiàn)出很好的活性[9]。本研究將黑木耳低聚糖用于嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、乳雙歧桿菌和植物乳桿菌的培養(yǎng)，篩選出益生效果最好的菌種，同時將黑木耳低聚糖應(yīng)用于復(fù)合微膠囊的壁材中，制備腸溶性復(fù)合微膠囊，并探究其形態(tài)特征、耐胃酸情況、腸道定點釋放情況以及儲藏穩(wěn)定性情況。這對擴大黑木耳低聚糖的應(yīng)用范圍以及改進腸道益生菌的包埋技術(shù)具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳子實體干品，吉得利食品有限公司；AB-8大孔樹脂，天津市鼎盛鑫化工有限公司；凍干型益生菌粉，山東中科嘉億生物工程有限公司；菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖和葡萄糖，山東保齡寶生物技術(shù)有限公司；乳清蛋白和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)，上海源葉生物科技有限公司；大豆油，山東魯花集團有限公司；胃蛋白酶，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白酶，美國Sigma公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

真空冷凍干燥機，美國Virtis公司；紫外分光光度計，上海光譜儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；高速分散機，德國ULTRA-TURRAX公司；動態(tài)散射粒徑與Zeta電位分析儀，美國Brookhaven公司；場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本Hitachi公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑木耳低聚糖的制備

根據(jù)前期的預(yù)實驗結(jié)果，黑木耳子實體按固液比1∶30在90 ℃恒溫水浴中浸提3 h，重復(fù)提取3 次，離心去渣后，加入3 倍體積的95%乙醇，靜置24 h，離心得上清液，旋蒸去除乙醇，加水復(fù)溶后用AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附3 h，用95%乙醇淋洗，洗脫液經(jīng)旋蒸去除乙醇后冷凍干燥密封備用[10-11]。

1.3.2 黑木耳低聚糖含量測定方法

本實驗采用高濃度的乙醇進行醇沉，絕大部分的多糖、蛋白質(zhì)和雜質(zhì)無法溶解在上清液中，在過濾時被除去，且前期預(yù)實驗表明黑木耳低聚糖中的單糖含量很低，因此低聚糖含量可用總糖含量來表示。故采用苯酚-硫酸法[12]測定其低聚糖含量。

1.3.3 菌種活化

取0.5 g益生菌菌粉溶于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，離心，用0.85%生理鹽水洗滌兩次，將菌體重新懸浮于20 mL 0.85%生理鹽水中。將濃縮菌液的濃度調(diào)至1010CFU/g。

1.3.4 黑木耳低聚糖體外益生活性篩選

參照Li等[13]的方法，將黑木耳低聚糖、葡萄糖和常見的益生元(菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖)等作為碳源加入到5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，使其最終質(zhì)量濃度分別為5，10，20，30，40 g/L，滅菌冷卻，分別加入40 μL植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌菌液，37 ℃厭氧厭氧培養(yǎng)12 h后，在600 nm處測定吸光度，無菌培養(yǎng)基作為空白對照，每組進行3 次平行實驗。

1.3.5 益生菌低聚糖復(fù)合微膠囊的制備方法

參照Heidebach等[14]和鄒強等[15]的方法，以及前期實驗中得到的最優(yōu)條件制備微膠囊：固化時間150 min，壁材復(fù)配比m(黑木耳低聚糖)∶m(熱變性乳清蛋白)=1∶4，芯壁比(體積比)為0.075∶1。將1.5 mL的濃縮菌液與10 mL熱變性(90 ℃，0.5 h)的乳清蛋白溶液(質(zhì)量濃度為100 g/L)和10 mL質(zhì)量濃度為25 g/L的黑木耳低聚糖溶液混合后，立即加入0.5 g的TGase(200 U/g)振蕩混勻。將混合液加入到盛有120 mL預(yù)熱至40 ℃的大豆油中。40 ℃下，1 200 r/min磁力攪拌150 min，離心(700g，5 min)，收集沉淀并用林格氏試劑(含體積分?jǐn)?shù)為5%的吐溫-80)清洗2 次，繼續(xù)離心5 min，重新收集沉淀部分，貯存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 復(fù)合微膠囊的包埋率測定

參照Doherty等[16]的方法，加入4.5 mL的解囊液進行破囊，并測定嗜酸乳桿菌微膠囊的包埋率，用活菌數(shù)計算包埋率。包埋率EE的計算公式為

式中：N為每克濕膠囊中的活菌總數(shù)，CFU/g；M為總濕膠囊質(zhì)量，g；N0為加入的濃縮菌液活菌總數(shù)，CFU。

1.3.7 黑木耳低聚糖對包埋率的影響

參照1.3.5中的方法，保證壁材濃度和固形物含量相同的前提下，對添加黑木耳低聚糖所制得的微膠囊(A)與不添加黑木耳低聚糖制得的微膠囊(B)進行對比，并測定包埋率，以探究黑木耳低聚糖對包埋率的影響。

1.3.8 復(fù)合微膠囊的形態(tài)測定

用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)觀察冷凍干燥后的復(fù)合微膠囊和噴霧干燥后的嗜酸乳桿菌菌粉(以麥芽糊精為載體)的表面結(jié)構(gòu)；動態(tài)散射粒徑與Zeta電位分析儀(DLS)測定冷凍干燥后的復(fù)合微膠囊(將其溶于蒸餾水中測定)平均粒徑及其粒徑分布。

1.3.9 復(fù)合微膠囊對模擬胃腸液的耐受性試驗

參考劉歡等[17]的方法配制模擬胃液、模擬腸液和解囊液。

將0.5 mL濃縮菌液或者0.5 g復(fù)合微膠囊加入到4.5 mL模擬胃液和腸液中，在37 ℃，100 r/min條件下前者培養(yǎng)30，60，90，120 min，后者培養(yǎng)1，2，3，4 h，之后加入解囊液，振蕩10 min至完全解囊后進行活菌計數(shù)，每組做3 次平行實驗。

1.3.10 復(fù)合微膠囊的儲藏穩(wěn)定性試驗

國食藥監(jiān)注[2005]202號文件《益生菌類保健食品申報與審評規(guī)定(試行)》[18]中指出：活菌類益生菌保健食品在其保質(zhì)期內(nèi)活菌數(shù)目不得少于6 log CFU/mL(g)。將冷凍干燥后的復(fù)合微膠囊和未包囊化的等量濃縮菌液放置于無菌的西林瓶中，封口后置于4，25 ℃環(huán)境下儲藏35 d，每隔7 d進行活菌計數(shù)，每組進行3 次平行實驗。

1.3.11 數(shù)據(jù)處理

實驗各組數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；數(shù)據(jù)繪圖采用Origin 2017軟件和GraphPad Prism8軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑木耳低聚糖的含量及其益生效果

經(jīng)測定，1.3.1提取得到的黑木耳低聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(78±0.2)%。由圖1(a)可知：黑木耳低聚糖和菊粉對嗜酸乳桿菌都有明顯的促進增殖作用，且黑木耳低聚糖的益生效果遠(yuǎn)大于菊粉和葡萄糖，黑木耳低聚糖的益生效果隨著質(zhì)量濃度的增加先上升后降低，在質(zhì)量濃度為20 g/L時，益生效果最好，這是由于黑木耳低聚糖到達一定質(zhì)量濃度時，造成高滲透壓環(huán)境，菌體細(xì)胞脫水，從而抑制了菌體生長[19]。由圖1(b，c)可知：黑木耳低聚糖對鼠李糖乳桿菌和乳雙歧桿菌均無明顯益生作用。由圖1(d)可知：黑木耳低聚糖對植物乳桿菌有促進增殖作用，且隨其質(zhì)量濃度的增加先上升后降低，但其益生效果比葡糖糖差。綜上所述，考慮到黑木耳低聚糖對嗜酸乳桿菌具有明顯的益生效果，后續(xù)將選用嗜酸乳桿菌作為芯材制備復(fù)合微膠囊。

圖1 腸道益生菌在不同碳源條件下的增殖情況Fig.1 Proliferation of intestinal probiotics under different carbon source conditions

2.2 黑木耳低聚糖對嗜酸乳桿菌包埋率的影響

實驗結(jié)果表明，壁材中加入黑木耳低聚糖的微膠囊包埋率為(78.8±0.1)%，不含黑木耳低聚糖的微膠囊包埋率為(57.3±0.2)%，由此可見在微膠囊中加入黑木耳低聚糖能夠顯著提高復(fù)合微膠囊的包埋率。復(fù)合微膠囊的包封效果與壁材中有無黑木耳低聚糖有著重要的關(guān)系，這可能是變性乳清蛋白和黑木耳低聚糖干燥后可以形成結(jié)構(gòu)緊密、無空隙、無黏連的微膠囊，將嗜酸乳桿菌包埋在其中[20]。單純使用變性乳清蛋白作為包埋壁材形成的微膠囊易破碎，結(jié)構(gòu)松散，機械強度低，易產(chǎn)生多孔結(jié)構(gòu)[21]，活菌容易流出。加入小分子的黑木耳低聚糖可以封閉微膠囊上的細(xì)孔和裂縫[22]，從而將嗜酸乳桿菌緊密地包封在里面，在進入胃腸道后可以保護嗜酸乳桿菌免受胃酸侵蝕，在腸道溶解后黑木耳低聚糖還能作為益生元，提供嗜酸乳桿菌增值所需碳源。

2.3 復(fù)合微膠囊的包埋率和形態(tài)

采用前期實驗中得到的最優(yōu)條件對嗜酸乳桿菌進行包埋，制備的微膠囊包埋率為(86.8±0.2)%，活菌數(shù)為(9.7±0.2) log CFU/g。

冷凍干燥后的復(fù)合微膠囊與噴霧干燥后的嗜酸乳桿菌菌粉的掃描電鏡觀察結(jié)果如圖2所示。由圖2(a)可知：黑木耳低聚糖和變性乳清蛋白作為壁材制備的復(fù)合微膠囊結(jié)構(gòu)完整，呈不規(guī)則球型聚集態(tài)，無裸露的嗜酸乳桿菌，微球與微球之間無黏連現(xiàn)象，表面凹凸不平，這是由于黑木耳低聚糖的高黏性而黏結(jié)在一起。復(fù)合微膠囊表面有褶皺現(xiàn)象但未見裂紋，這與冷凍干燥過程中水分的喪失以及壁材的表面活性有關(guān)[23]。由圖2(b)可知：以麥芽糊精為載體的嗜酸乳桿菌經(jīng)過噴霧干燥處理后，被包覆在麥芽糊精中，但表面裸露大量的嗜酸乳桿菌，使其易受到外界環(huán)境影響，起不到很好的保護作用，噴霧干燥后的微球形狀雜亂無序，大小不均一，無黏結(jié)現(xiàn)象。綜上所述，微膠囊化可以對嗜酸乳桿菌起到保護作用，隔絕外界不利環(huán)境。

圖2 復(fù)合微膠囊與嗜酸乳桿菌菌粉的掃描電鏡觀察結(jié)果Fig.2 SEM observation results of compound microcapsule and Lactobacillus acidophilus powder

DLS測定結(jié)果顯示(圖3)，復(fù)合微膠囊的平均粒徑為41.7 μm，粒徑分布范圍較窄，粒徑大小較為均一，說明本方法制備的微膠囊大小比較均一。

圖3 復(fù)合微膠囊(濕)的粒徑分布Fig.3 Particle size distribution of composite microcapsules (wet)

2.4 復(fù)合微膠囊對模擬胃腸液的耐受性試驗結(jié)果

由圖4(a)可知：在模擬胃液環(huán)境下，復(fù)合微膠囊和濃縮菌液中的嗜酸乳桿菌的數(shù)量在120 min內(nèi)持續(xù)降低，說明酸性環(huán)境對嗜酸乳桿菌有極大的破壞性[24]。在低pH條件和胃蛋白酶作用下，濃縮菌液的活菌數(shù)迅速下降直至為0，而復(fù)合微膠囊在培養(yǎng)30 min后雖略有下降，但逐漸穩(wěn)定下來。在模擬胃液中120 min后，復(fù)合微膠囊中嗜酸乳桿菌活菌數(shù)下降了30.6%，減少量比濃縮菌液中的低約3 個數(shù)量級，包埋后的復(fù)合微膠囊相對活力損失顯著降低，這與常柳依等[8]向微膠囊中添加海洋寡糖作為益生元的結(jié)果相似，這是由于變性乳清蛋白在微膠囊表面形成了保護性涂層，同時黑木耳低聚糖無法被胃液消化酶解，進而對嗜酸乳桿菌起到較好的保護作用，使嗜酸乳桿菌有很好的抗胃酸能力[25]。微膠囊中包埋的益生菌能在人體特定部位釋放，對人體健康有著重要的意義[26-27]，由圖4(b)可知：在模擬腸液環(huán)境下，濃縮菌液和復(fù)合微膠囊中的嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)并未發(fā)生顯著降低。濃縮菌液在未進行保護的條件下培養(yǎng)3 h后，活菌數(shù)下降了2 個數(shù)量級；而包埋后的復(fù)合微膠囊在1 h時反而出現(xiàn)活菌數(shù)增長的現(xiàn)象，這是由于復(fù)合微膠囊中的嗜酸乳桿菌在腸液中釋放后利用黑木耳低聚糖進行增殖引起的，在腸液中4 h后，活菌數(shù)僅下降了8.4%，說明以黑木耳低聚糖為壁材制備的復(fù)合微膠囊腸溶性好，存活率高。

圖4 復(fù)合微膠囊和濃縮菌液在模擬胃液和模擬腸液中的菌體存活情況Fig.4 Survival of live bacteria in simulated gastric juice and simulated intestinal juice by composite microcapsule and concentrated bacterial liquid

2.5 復(fù)合微膠囊的儲藏穩(wěn)定性

微膠囊在儲存期間活菌數(shù)的減少主要是由于菌體細(xì)胞膜脂質(zhì)的氧化，因此環(huán)境溫度和微膠囊含水量是影響活菌數(shù)量的關(guān)鍵因素[28-29]。從圖5可以看出：隨著儲藏時間的增長，復(fù)合微膠囊和濃縮菌液中的活菌數(shù)都處于下降狀態(tài)，且濃縮菌液的下降速率比復(fù)合微膠囊的快。包埋后的嗜酸乳桿菌在儲藏期間的穩(wěn)定性顯著增強，在4 ℃條件下儲藏的復(fù)合微膠囊中的活菌數(shù)下降速率比25 ℃的慢，這是由于儲存溫度越高，越容易導(dǎo)致膜脂質(zhì)的氧化，從而導(dǎo)致菌體死亡。在4 ℃條件下經(jīng)過35 d的儲藏，復(fù)合微膠囊內(nèi)嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)為(8.5±0.1) log CFU/g；在25 ℃條件下經(jīng)過35 d的儲藏，復(fù)合微膠囊內(nèi)嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)為(6.3±0.1) log CFU/g，均達到了《益生菌類保健食品申報與審評規(guī)定(試行)》中活菌數(shù)目不得少于6 log CFU/mL(g)的要求[18]。

圖5 復(fù)合微膠囊和濃縮菌液在4，25 ℃下的存活率變化Fig.5 Survival rate changes of composite microcapsules and concentrated bacterial liquid at 4, 25 ℃

3 結(jié) 論

根據(jù)黑木耳低聚糖對不同益生菌的益生結(jié)果，選取益生效果最好的嗜酸乳桿菌進行包埋，所得的微膠囊包埋率為86.8%，平均粒徑約為41.7 μm，在掃描電鏡下呈不規(guī)則球型聚集態(tài)。在復(fù)合微膠囊耐貯性試驗與耐受性試驗中，包埋后的益生菌對模擬胃腸液的耐受性更高，在胃液中2 h后，活菌數(shù)下降了30.9%，在腸液中4 h后，活菌數(shù)僅下降了8.4%；復(fù)合微膠囊凍干粉在4，25 ℃條件下儲藏35 d后，活菌數(shù)分別為8.5，6.3 log CFU/g，均達到了益生菌類保健食品中的指標(biāo)。以黑木耳低聚糖作為微膠囊新型材料，在提高微膠囊化嗜酸乳桿菌貯藏性能的同時，還能提高微膠囊服用過程中嗜酸乳桿菌對胃液的耐受性，在腸道溶解后還能作為益生菌的益生元，使嗜酸乳桿菌在腸道溶解、釋放后仍能保持較好的活性。此結(jié)果為進一步開發(fā)食用菌微生態(tài)制劑提供了依據(jù)，同時對食用菌的精深加工和腸道益生菌包埋技術(shù)的探究具有重要的現(xiàn)實意義。