高爾基體整合膜蛋白4在人頭頸癌中的表達(dá)及臨床意義

肖國(guó)岫 鄭義彩 吳 情 曾飛躍 徐 斌

頭頸癌是指起源于鼻、口腔、咽喉等部位上皮惡性腫瘤，其中90%以上為鱗癌，即頭頸鱗癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）[1]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，2012年HNC患者約占惡性腫瘤患者的4.9%，死亡人數(shù)約占惡性腫瘤死亡人數(shù)的4.6%，且其發(fā)病率和死亡率具有逐年上升趨勢(shì)[2]?；陬^頸部解剖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和暴露患者器官功能的重要性，HNC治療較為復(fù)雜，而探究HNC的發(fā)病機(jī)制對(duì)提供新的治療思路和方法具有重要意義。高爾基體整合膜蛋白4（golgi integral membrane protein 4，GOLIM4）是高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物的重要組成部分，參與高爾基體蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)過程[3]。有部分研究報(bào)道高爾基體相關(guān)蛋白可能參與了惡性腫瘤的生物學(xué)過程，但目前相關(guān)研究較少[4]。本次研究以我院收治的72例HNC患者為研究對(duì)象，探究GOLIM4在HNC中的表達(dá)及與臨床病理關(guān)系，以期為臨床診療提供一定參考依據(jù)。

資料和方法

1.組織標(biāo)本及臨床資料

選取2015年1月～2018年6月我院收治的72例HNSCC患者，包括58例口腔癌、12例口咽癌和2例喉癌，采集患者鱗癌組織作為HNSCC組。患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①HNSCC患者符合《頭頸部腫瘤綜合治療專家共識(shí)》[5]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②取鱗癌組織前患者未經(jīng)過放化療；③年齡20歲及以上；④患者知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病理資料不完整或無法隨訪；②隨訪過程中遵照醫(yī)囑治療；③具有免疫治療或放化療史。另選對(duì)應(yīng)的頭頸部正常組織（病理活檢或外科手術(shù)時(shí)取得）37例作為對(duì)照組。本次研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)通過。收集患者臨床資料，包括患者性別、年齡、腫瘤直徑、病理分級(jí)、臨床分期及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移等。臨床分期和分化程度參考第8版AJCC頭頸癌分期指南[6]分為T1-T4期。采用影像學(xué)、頸部觸診、纖維喉鏡等檢查結(jié)果或手術(shù)確定患者腫瘤是否轉(zhuǎn)移。隨訪5年，記錄患者生存情況。

2.免疫組化

組織標(biāo)本經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、切片后，按照試劑盒說明書采用兩組染色法進(jìn)行操作：烤片、脫蠟、抗原修復(fù)、消除內(nèi)源性過氧化物酶活性、血清封閉，隨后加入一抗（4℃過夜）、二抗（37℃ 2h），DAB顯色，待細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性。

3.RT-PCR檢測(cè)GOLIM4 mRNA表達(dá)

分離提取的新鮮組織標(biāo)本，加入Trizol試劑提取總RNA，測(cè)定濃度后取5μl逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板在PCR儀（LightCycler 480型）上進(jìn)行定量檢測(cè)，GOLIM4引物：上游，5'-AAACTCTATGCT CCCACCC-3'，下游 5'-GCTGCTCTTTCCACTCCC-3'，內(nèi)參GAPDH引物：上游5'-TGACTTCAACAGCGAC ACCCA-3'，下游:5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAA A-3'。計(jì)算待測(cè)基因相比正常組織中表達(dá)改變的倍數(shù)，結(jié)果以2-△△Ct表示為GOLIM4mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

4.Western blot檢測(cè)GOLIM4蛋白表達(dá)

獲取組織細(xì)胞裂解物，采用BCA檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，隨后采用SDS-PAGE電泳，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，加一抗（4℃過夜）、二抗（室溫 2h）、顯影，采用 Image lab拍照，并進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布計(jì)量資料以（χ±S）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率“%”表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。記P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.兩組GOLIM4 mRNA及蛋白表達(dá)情況比較

HNSCC組中GOLIM4mRNA及蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，GOLIM4主要表達(dá)在胞漿中，且在對(duì)照組中低表達(dá)，在HNSCC組呈現(xiàn)高表達(dá)，見圖1。

表1 2組GOLIM4 mRNA及蛋白表達(dá)情況比較（χ±S）

圖1 免疫組化檢測(cè)GOLIM4表達(dá)情況

2.GOLIM4mRNA表達(dá)與頭頸癌患者臨床分期關(guān)系

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，GOLIM4mRNA表達(dá)與病理分級(jí)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且病理分級(jí)T3-T4級(jí)患者GOLIM4mRNA表達(dá)水平高于T1-T2級(jí)，臨床分期Ⅲ-Ⅳ期GOLIM4mRNA表達(dá)水平高于Ⅰ-Ⅱ期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者GOLIM4mRNA表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 2。

3.GOLIM4表達(dá)與頭頸癌患者病理分級(jí)關(guān)系

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，GOLIM4蛋白表達(dá)與病理分級(jí)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且病理分級(jí)T3-T4級(jí)患者GOLIM4蛋白表達(dá)水平高于T1-T2級(jí)，臨床分期Ⅲ-Ⅳ期GOLIM4蛋白表達(dá)水平高于Ⅰ-Ⅱ期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者GOLIM4蛋白表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 3。

4.GOLIM4表達(dá)與頭頸癌患者預(yù)后關(guān)系

72例HNSCC患者的5年生存率為47.2%（34/72），其中生存組GOLIM4mRNA及蛋白表達(dá)水平低于死亡組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表2 GOLIM4 mRNA表達(dá)與頭頸癌患者臨床分期關(guān)系（χ±S）

表3 GOLIM4蛋白表達(dá)與頭頸癌患者病理分級(jí)關(guān)系（χ±S）

表4 預(yù)后不同患者GOLIM4 mRNA及蛋白表達(dá)情況比較（χ±S）

討 論

頭頸部惡性腫瘤的絕大部位病理表現(xiàn)為鱗狀細(xì)胞癌，由于頭頸部復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)移途徑，有70%左右患者在確診時(shí)已為晚期[7]。而HNSCC癌細(xì)胞浸潤(rùn)程度深、病變范圍較大，行手術(shù)切除區(qū)域較大，患者預(yù)后及生存率均不夠理想[8]。因此探究HNSCC的發(fā)病機(jī)制對(duì)提供新的治療思路和方法具有重要意義。腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程涉及多種復(fù)雜物質(zhì)能量代謝變化及細(xì)胞信號(hào)通路傳導(dǎo)，高爾基體是細(xì)胞中蛋白質(zhì)的重要加工場(chǎng)所，參與了細(xì)胞分化和多種信號(hào)通路傳導(dǎo)過程。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)部分高爾基體相關(guān)蛋白如高爾基體蛋白73（GP73）[9]、高爾基體基質(zhì)蛋白130（GM130）[10]等與腫瘤生物學(xué)行為密切相關(guān)。有學(xué)者推測(cè)高爾基體可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體蛋白質(zhì)加工和物質(zhì)能量代謝從而參與了腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡過程[11]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)高爾基體功能障礙可影響腫瘤的形成，其原因可能來自于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體的相互作用[12]，但目前具體機(jī)制尚不明確。本次通過在分子生物學(xué)水平對(duì)高爾基體相關(guān)蛋白GOLIM4表達(dá)進(jìn)行研究，以期為HNSCC發(fā)病機(jī)制研究和臨床診療提供參考依據(jù)。

GOLIM4是一種分子量為130kDa的Ⅱ型高爾基體蛋白，整合到順式/內(nèi)側(cè)高爾基體中并在高爾基體和核體間循環(huán)，對(duì)高爾基體具有修飾功能[13]。目前關(guān)于GOLIM4表達(dá)在腫瘤中研究較少。本次研究發(fā)現(xiàn)，HNSCC組中GOLIM4 mRNA及蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，提示GOLIM4在HNSCC中表達(dá)水平明顯上調(diào)，推測(cè)原因可能與GOLIM4表達(dá)能影響細(xì)胞中Ca+濃度平衡有關(guān)。細(xì)胞Ca+濃度平衡對(duì)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、分化、凋亡等多種信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)作用，而與GOLIM4結(jié)合的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)基質(zhì)相互作用分子蛋白（STIM1）是鈣庫操作性鈣內(nèi)流（SOCE）通路的組成蛋白，在維持Ca+穩(wěn)態(tài)中起到關(guān)鍵作用[14]。在有學(xué)者采用慢病毒感染干擾下咽鱗癌細(xì)胞中GOLIM4表達(dá)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖活性受到抑制，且STIM1水平也明顯降低，推測(cè)GOLIM4可能通過影響STIM1表達(dá)調(diào)節(jié)Ca+穩(wěn)態(tài)，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖過程[15]。RT-PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，GOLIM4 mRNA及蛋白表達(dá)與臨床分期、病理分級(jí)和腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示GOLIM4參與了HNSCC進(jìn)展過程。已有研究發(fā)現(xiàn)GOLIM4過表達(dá)可激活結(jié)腸癌患者體內(nèi)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與了結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和腫瘤組織的生長(zhǎng)[16]，還有研究發(fā)現(xiàn)GOLIM4可影響高爾基體中磷脂酰肌醇-4-磷酸（PIP）活性，而PIP可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的粘附力而影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[17]，因此推測(cè)本研究中GOLIM4可能也通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路或PIP活性影響HNSCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，從而影響HNSCC的進(jìn)展，但具體情況有待進(jìn)一步研究。隨訪5年，生存組GOLIM4 mRNA及蛋白表達(dá)水平低于死亡組，提示GOLIM4在預(yù)后較好的HNSCC患者中表達(dá)水平較低，能有助于HNSCC的臨床病情評(píng)估和預(yù)后預(yù)測(cè)。

綜上所述，GOLIM4在HNSCC中表達(dá)上調(diào)，且與患者臨床病理相關(guān)，對(duì)患者病情評(píng)估和預(yù)后預(yù)測(cè)具有一定的臨床價(jià)值，其中作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究和論證，而GOLIM4可為HNSCC臨床治療提供新的靶點(diǎn)和思路。