碳酸鈣和根際作用對(duì)酸性紅壤解磷微生物豐度的影響①

鄭曼曼，王 超，沈仁芳

(1 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國科學(xué)院南京土壤研究所)，南京 210008；2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

在中國，酸性土壤(pH＜5.5)總面積約2.18 億km2，主要分布在南方熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。酸性土壤中，磷缺乏是限制農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要因素之一，在酸性紅壤區(qū)尤為明顯[2]。盡管土壤中存在大量的磷，但是植物能夠吸收利用的有效磷比例卻很低[3]，主要?dú)w因于酸性土壤中磷極易與Fe3+和Al3+結(jié)合形成難溶態(tài)磷酸鹽，以及被固定到有機(jī)物中[4]。提高土壤磷庫中難溶性磷素的活化利用是節(jié)約磷肥資源和提高酸性土壤生產(chǎn)潛力的重要途徑。解磷微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，是土壤難溶性磷活化和形態(tài)轉(zhuǎn)化的主要驅(qū)動(dòng)者[5-6]。發(fā)揮解磷微生物功能是緩解土壤缺磷的一個(gè)有效途徑[3]。通過分泌磷酸酶，降解植酸鹽、磷脂等含磷有機(jī)化合物，釋放可溶性磷酸鹽是土壤解磷微生物的一個(gè)重要功能[7]。磷酸酶活性是反映土壤有機(jī)磷礦化潛力的一個(gè)重要指標(biāo)，根據(jù)其最適pH 分為酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(ALP)[8]。ACP 和ALP 是非特異性磷酸水解酶，能夠水解許多正磷酸單酯(植酸除外)以獲取正磷酸鹽[9]。目前已經(jīng)克隆出了編碼ACP 的基因phoC[10]和編碼ALP 的基因phoD[11]。這些解磷微生物功能基因的克隆為檢測環(huán)境中解磷菌種類、豐度、分布狀況和群落結(jié)構(gòu)組成提供了有效手段。

一些農(nóng)藝措施，比如碳酸鈣廣泛應(yīng)用于酸性土壤改良[12]。施用碳酸鈣能夠顯著降低土壤酸度[13]，增加作物產(chǎn)量[14]。Wang 等[13]研究表明，酸性土壤中添加碳酸鈣能夠顯著增加細(xì)菌16S rRNA 基因豐度，主要原因是碳酸鈣降低了土壤酸毒害和鋁毒害水平。Acosta-Martínez 和Tabatabai[15]指出碳酸鈣施用可增加微生物數(shù)量和多樣性及土壤酶活性。在土壤-植物系統(tǒng)中，碳酸鈣還通過改善植物生長和根際環(huán)境，間接影響根際微生物。植物根際環(huán)境變化可影響微生物功能、豐度和群落組成[16]。然而，碳酸鈣添加對(duì)酸性土壤中解磷微生物，特別是對(duì)作物根際解磷微生物的影響還關(guān)注較少。

鑒于解磷微生物在土壤磷轉(zhuǎn)化和有效性方面的重要作用，本研究通過設(shè)置碳酸鈣添加試驗(yàn)，分析酸性土壤中玉米根際和非根際磷酸酶活性及phoC和phoD基因豐度，并探究它們與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性，以期闡明碳酸鈣和根際作用對(duì)酸性紅壤磷酸酶活性和解磷微生物豐度的影響。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)材料和設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)所用酸性紅壤采自江西省鷹潭市農(nóng)田，土壤基本理化性質(zhì)為pH 4.38，有機(jī)質(zhì) 16.79 g/kg，全氮 0.58 g/kg，全磷 0.39 g/kg，全鉀 10.62 g/kg，有效磷 6.37 mg/kg。試驗(yàn)時(shí)每盆裝土1.50 kg，并施用0.20 g/kg磷酸二氫鉀和0.50 g/kg硫酸銨作為基肥。試驗(yàn)設(shè)置了不添加碳酸鈣(CK)、每千克土添加0.3 g碳酸鈣(Ca-0.3)和0.5 g 碳酸鈣(Ca-0.5)3 個(gè)碳酸鈣水平處理，同時(shí)設(shè)置了各處理未種植物的對(duì)照(作為非根際土壤)。每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)在人工氣候生長室進(jìn)行，光照 14 h(30℃)，光照強(qiáng)度為400 μmol/(m2·s)，黑暗10 h(25℃)，相對(duì)濕度為65%。玉米品種鄭單958 為試驗(yàn)材料，種植植物處理每盆播種10 粒玉米種子，土壤含水量保持在20%(w/w)。玉米地上部長到1 cm 時(shí)間苗，每盆定植3 棵幼苗。自間苗之日起，進(jìn)行為期3 周的培養(yǎng)。

1.2 植物樣品采集和元素測定

收獲時(shí)測量玉米株高，玉米樣品分別收集根系和地上部，用蒸餾水沖洗后于105℃殺青，隨后70℃烘干至恒重，稱重。地上部樣品粉碎，經(jīng)H2SO4-H2O2消煮后用凱氏定氮儀(Hanon K9860)測定氮含量；經(jīng)HNO3消煮后，用ICP-AES(IRIS-Advantage，Thermo Elemental，MA，USA)檢測磷、鉀和鈣元素含量。

1.3 土壤樣品采集和土壤理化性質(zhì)測定

采用抖根法收集根際土壤，未種植玉米的土壤為非根際土。土壤樣品采集后分3 份保存：用于提取DNA 的土壤樣品放置于 -20℃ 冰箱；用于測定土壤磷酸酶活性的土壤放置于4℃冰箱；其余土壤經(jīng)風(fēng)干、研磨后用于測定土壤理化性質(zhì)。土壤pH 按照土水質(zhì)量比1∶2.5 振蕩后，用pH 計(jì)測定；土壤全碳(TC)和全氮(TN)采用CNS 元素分析儀測定；土壤銨態(tài)氮(NH-N)和硝態(tài)氮(NO-N)采用氯化鉀浸提-流動(dòng)分析儀法測定；土壤中全磷(TP)、全鉀(TK)、有效磷(AP)、速效鉀(AK)、交換性鈣(ECa)測定方法詳見《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[17]。土壤酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(ALP)活性測定參照Tabatabai[18]描述的方法。

1.4 土壤DNA 提取和基因豐度測定

采用DNA 試劑盒(FastDNA SPIN Kit for soil)提取土壤DNA。解磷微生物功能基因phoC和phoD擴(kuò)增的通用引物分別為phoc-A-F1(5′-CGGCTCCT ATCCGTCCGG-3′)/phoc-A-R1(5′-CAACATCGCTTT GCCAGTG-3′)[10]和ALPS-F730(5′-CAGTGGGACGA CCACGAGGT-3′)/ALPS-R1101(5′-GAGGCCGATCG GCATGTCG-3′)[11]?；蜇S度采用LightCycler 480 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)測定。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)反應(yīng)體系為10 μl，包含1 μl DNA 溶液、0.4 μl 正向引物、0.4 μl反向引物、5 μl SYBR Premix ExTaq(Takara Bio，Inc.，Janpan)和3.2 μl 滅菌水。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。為了獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，目的基因phoC和phoD片段分別連接到pMD19-T 載體(Takara，Dalian，China)上，并用Escherichia coliDH5α 完成轉(zhuǎn)化。經(jīng)篩選、測序驗(yàn)證后，采用質(zhì)粒提取試劑盒(Takara，Dalian，China)提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒用ddH2O 進(jìn)行10 倍梯度稀釋，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。基因phoC和phoD的PCR 擴(kuò)增效率分別為98.2%(R2= 0.99)和105.5%(R2= 0.98)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2007，統(tǒng)計(jì)分析使用軟件 SPSS20.0。根際與非根際之間顯著性差異采用T 檢驗(yàn)；不同處理之間顯著性差異采用Duncan 檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson 分析。作圖使用軟件SigmaPlot 10.0。

2 結(jié)果

2.1 碳酸鈣對(duì)玉米生長和土壤理化性質(zhì)的影響

Ca-0.3 和Ca-0.5 處理下玉米株高和生物量均顯著高于CK，并顯著增加了地上部氮、磷、鉀和鈣的吸收量(表1)。碳酸鈣添加顯著提高非根際土壤pH和NO-N、AP、ECa 含量，但降低NH-N 含量(表2)。碳酸鈣添加顯著提高根際土壤NO-N、AP、ECa含量，但顯著降低NH-N 和AK 含量。根際土壤中TC 和NO-N 含量顯著高于非根際土壤，但土壤pH和NH-N、AK、ECa 含量顯著低于非根際土壤。

表1 碳酸鈣處理下玉米生長性狀及地上部元素含量Table 1 Maize growth characteristics and N, P, K, Ca contents in maize shoots under CaCO3 treatments

表2 碳酸鈣處理下根際和非根際土壤理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of non-rhizosphere and rhizosphere soils under CaCO3 treatments

2.2 酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性

在CK、Ca-0.3 和Ca-0.5 處理樣品中非根際土壤ACP 活性(單位：pNP，mg/(kg·h))分別為63.79 ± 4.42、63.05 ± 4.87 和57.09 ± 3.69，明顯低于根際土壤(分別為81.46 ± 3.50、80.73 ± 7.58 和71.01 ± 9.09)，且在CK 和Ca-0.3 處理中差異達(dá)顯著水平(P＜0.01 或P＜0.05)(圖1A)。然而，非根際或根際土壤ACP 活性在不同碳酸鈣處理間均無顯著差異(圖1A)。非根際土壤ALP 活性隨碳酸鈣用量的增加而增加，且Ca-0.5 處理顯著高于前兩個(gè)碳酸鈣處理(圖1B)，但在根際土壤中各碳酸鈣處理間無顯著影響。各碳酸鈣處理根際土壤ALP 活性均顯著高于非根際土壤(P＜0.01 或P＜0.05)(圖1B)。

圖1 碳酸鈣處理下根際和非根際土壤ACP(A)和ALP(B)活性Fig. 1 Activities of ACP (A) and ALP (B) of non-rhizosphere and rhizosphere soils under CaCO3 treatments

2.3 解磷微生物功能基因phoC 和phoD 拷貝數(shù)

碳酸鈣添加未顯著影響根際和非根際土壤phoC基因拷貝數(shù)(圖 2A)。雖然根際作用增加了phoC基因拷貝數(shù)，但是統(tǒng)計(jì)上差異未達(dá)到顯著水平。圖2B 顯示，phoD基因拷貝數(shù)隨碳酸鈣用量的增加而增加，Ca-0.5 處理顯著高于CK。3 個(gè)碳酸鈣處理根際土壤phoD基因拷貝數(shù)均顯著高于非根際土壤(P＜0.01)。線性回歸分析表明，ACP 活性與phoC基因拷貝數(shù)在非根際(P＜0.01)和根際(P＜0.05)土壤中均呈顯著正相關(guān)(圖3A)。ALP 活性與phoD基因拷貝數(shù)相關(guān)性在根際土壤中達(dá)到顯著水平(P＜0.05)(圖3B)。

圖2 碳酸鈣處理下非根際和根際土壤phoC(A)和phoD(B)基因拷貝數(shù)Fig. 2 phoC (A) and phoD (B) gene copy numbers of non-rhizosphere and rhizosphere soils under CaCO3 treatments

圖3 土壤磷酸酶活性與phoC(A)和phoD(B)基因拷貝數(shù)相關(guān)性Fig. 3 Correlations between soil phosphate activities and phoC (A) and phoD (B) genes copy numbers

2.4 土壤磷酸酶活性和基因拷貝數(shù)與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

非根際土壤中，ACP 活性與TK 呈顯著負(fù)相關(guān)，而phoC基因拷貝數(shù)與NH-N、TP 含量呈顯著正相關(guān)；ALP 活性與土壤pH、ECa 含量呈顯著正相關(guān)，與NH-N 含量呈顯著負(fù)相關(guān)，而phoD基因拷貝數(shù)與NO-N、ECa 含量呈顯著正相關(guān)(表3)。根際土壤中，phoC基因拷貝數(shù)與NO-N 含量呈顯著負(fù)相關(guān)，phoD基因拷貝數(shù)與pH 及AP、ECa 含量均呈顯著正相關(guān)，而與NH-N 含量呈顯著負(fù)相關(guān)(表3)。

表3 土壤中磷酸酶活性、phoC 和phoD 基因拷貝數(shù)與土壤理化性質(zhì)的Pearson 相關(guān)分析Table 3 Pearson correlations between phosphate activities, phoC, phoD gene copy numbers and soil physicochemical properties

3 討論

土壤酶參與養(yǎng)分循環(huán)，并反映土壤微生物活動(dòng)[8]。解磷微生物能夠通過分泌磷酸酶參與土壤有機(jī)磷礦化，提高土壤磷素有效性。Acosta-Martínez 和Tabatabai[15]研究表明碳酸鈣施用顯著增加土壤pH 和ALP 活性，但是降低ACP 活性。類似地，本研究中碳酸鈣添加顯著提高土壤ALP 活性和phoD基因拷貝數(shù)，表現(xiàn)出降低ACP 活性和phoC基因拷貝數(shù)的趨勢(圖1 和圖2)，這可能與碳酸鈣對(duì)土壤pH 的提高作用有關(guān)。兩種磷酸酶產(chǎn)生主要取決于外界環(huán)境pH，ACP 在酸性土壤中較多，而中性或堿性土壤中ALP 較為常見[19]。非根際土壤ACP 和ALP 活性分別與pH 呈負(fù)相關(guān)和正相關(guān)(表3)，充分證明這個(gè)結(jié)果。與Dick 等[8]研究一致，酸性土壤ACP 活性顯著高于ALP(圖1)，表明酸性土壤中ACP 在礦化有機(jī)磷方面起主導(dǎo)作用。

土壤酶活性對(duì)土壤管理引起的土壤理化性質(zhì)變化很敏感，并且不同類型酶的敏感程度存在明顯差異[20]。本研究中，碳酸鈣添加顯著影響非根際土壤ALP 及非根際和根際土壤phoD基因拷貝數(shù)(圖1B 和2B)，但對(duì)ACP 活性和phoC基因拷貝數(shù)影響不顯著(圖1A 和2A)。Acosta-Martínez 和Tabatabai[15]發(fā)現(xiàn)土壤ALP 活性相較于ACP 更易受碳酸鈣的影響。磷酸酶活性和基因拷貝數(shù)與土壤理化性質(zhì)間相關(guān)分析也表明，ALP 活性與phoD基因拷貝數(shù)更易受土壤理化因子的影響(表3)，因此，ACP 和ALP 對(duì)碳酸鈣的響應(yīng)差異也支持了先前研究。磷酸酶是一類誘導(dǎo)酶，磷缺乏能夠誘導(dǎo)植物根系和微生物分泌磷酸酶和促進(jìn)磷酸酶活性增加，而磷酸酶的形態(tài)又與土壤pH 密切相關(guān)[8-9]。ALP 對(duì)碳酸鈣響應(yīng)強(qiáng)于ACP，證明碳酸鈣能夠促進(jìn)土壤微生物生長，尤其是phoD基因相關(guān)的微生物種類。這可能歸因于ALP 并不來自于植物，僅由微生物分泌[9]。此外，楊艷菊等[21]報(bào)道土壤中鈣離子含量顯著影響解磷微生物的生長。本研究發(fā)現(xiàn)非根際ALP 活性和phoD基因拷貝數(shù)與ECa 含量呈顯著正相關(guān)，這也部分解釋了ALP 活性與phoD基因拷貝數(shù)對(duì)碳酸鈣響應(yīng)強(qiáng)于ACP 活性和phoC基因拷貝數(shù)。此外，Zaheer 等[22]研究表明，鈣離子能夠激發(fā)ALP 活性，添加鈣離子(0.5 ～ 2.0 mmol/L)能夠使ALP 活性提升約2.5 倍。鈣離子的存在在很大程度上保護(hù)ALP 免受其他金屬離子的抑制作用，說明磷酸酶對(duì)鈣離子有較高的親和力。

根際是植物能量和物質(zhì)代謝最活躍的區(qū)域。植物根系釋放的各種分泌物可以選擇性地刺激微生物種群生長，因此，根際土壤形成了獨(dú)特的微生物群落[23-24]。在各種環(huán)境條件下，已經(jīng)廣泛報(bào)道了根際土壤微生物豐度和活性遠(yuǎn)高于非根際土壤[13,25]，其中解磷微生物的分布表現(xiàn)出強(qiáng)烈的根際效應(yīng)[26]。植物生長引起根系分泌物增加和養(yǎng)分吸收增強(qiáng)能夠刺激根際微生物的解磷功能[10,27]。在本研究所有處理中根際土壤phoC、phoD基因拷貝數(shù)和磷酸酶活性均高于非根際土壤，尤其是phoD基因拷貝數(shù)和ALP 活性(圖1 和圖2)，表明根際土壤具有較高的解磷微生物活性，并對(duì)磷酸酶活性有促進(jìn)作用。這強(qiáng)烈地暗示根際區(qū)域可能存在更高水平的生物解磷作用。

4 結(jié)論

綜上所述，ACP 在酸性土壤有機(jī)磷礦化方面強(qiáng)于ALP，其活性不易受碳酸鈣處理的影響。雖然碳酸鈣和根際效應(yīng)均影響解磷微生物功能和豐度，但是根際效應(yīng)更為強(qiáng)烈，主要表現(xiàn)在增加了磷酸酶活性和phoD基因豐度。因此，調(diào)控作物生長對(duì)促進(jìn)酸性土壤解磷微生物功能具有重要指導(dǎo)意義。