狼瘡性腎炎患者外周血單個核細(xì)胞中miR-21、miR-423的表達(dá)水平及臨床意義

溫莉玲，陳家佳，梁紅麗

(海南省第三人民醫(yī)院腎內(nèi)科，海南三亞 572000)

狼瘡性腎炎(LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)累及腎臟，導(dǎo)致不同病理類型免疫損傷的一種疾病，可伴有蛋白尿、血尿、貧血等一系列并發(fā)癥，10%～30%的LN患者會發(fā)展為腎衰竭，而腎衰竭是導(dǎo)致SLE患者死亡的主要原因[1]。有研究表明，微小RNA(miRNA)作為高度保守的內(nèi)源性小分子RNA，通過促進(jìn)細(xì)胞活化、分化、凋亡、代謝及信號傳導(dǎo)等機(jī)制，參與調(diào)控LN的發(fā)生、發(fā)展[2-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-21(miR-21)、微小RNA-423(miR-423)與免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子和免疫復(fù)合物形成、沉積等免疫異常表現(xiàn)有關(guān)，可能在LN的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[4-5]。本研究通過檢測LN患者外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中miR-21及miR-423的表達(dá)水平，并分析其與LN患者疾病活動度的相關(guān)性，以期為LN的發(fā)病機(jī)制研究及靶向治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2019年9月本院收治的LN患者118例作為LN組，其中男17例，女101例；年齡17～63歲，平均(34.85±9.72)歲。根據(jù)國際腎臟病學(xué)會及腎臟病理學(xué)會制訂的LN分型標(biāo)準(zhǔn)，將118例LN患者分為LN Ⅱ～Ⅲ型組39例，Ⅳ型組47例，Ⅴ～Ⅵ型組32例。根據(jù)SLE疾病活動度指數(shù)(SLEDAI)評分，將118例LN患者分為LN穩(wěn)定組40例(SLEDAI評分<10分)，LN活動組78例(SLEDAI評分≥10分)。根據(jù)K/DOQI指南中慢性腎臟病分期標(biāo)準(zhǔn)，將118例LN患者分為早期LN組79例，晚期LN組39例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)SLE診斷符合美國風(fēng)濕病學(xué)會診斷標(biāo)準(zhǔn)，且LN經(jīng)腎臟病理活檢證實(shí)；(2)臨床資料及病理資料完整，能配合本次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并急性腎損傷、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病及其他自身免疫性疾病；(2)近1個月內(nèi)服用過免疫抑制劑、激素；(3)妊娠期或哺乳期女性。另選取50例健康體檢者作為對照組，其中男10例，女40例；年齡20～65歲，平均(36.20±9.46)歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1實(shí)時熒光定量PCR檢測 miR-21上游引物：5′-AGACATCATACAGAGTGTCG-3′，下游引物：5′-GCATCTAGGATCGACGTG-3′；miR-423上游引物：5′-GACTGTCAGCTGACATACAG-3′，下游引物：5′-ACTGACGATGAATACTAG-3′。抽取外周血4 mL于肝素鈉抗凝管中，分離PBMC，提取和純化miR-21、miR-423，然后在ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)上進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測。反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL)：1 μL引物及探針Mix(20×)，10 μL TaqMan通用混合物溶液(2×)，1.33 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，7.67 μL無核酸酶水。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃復(fù)性60 s，45個循環(huán)。每個反應(yīng)體系中熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值，采用2-ΔΔCt法計算miR-21及miR-423的相對表達(dá)水平。

1.2.2實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體水平，試劑由上?？菩律锛夹g(shù)股份有限公司提供；紅細(xì)胞沉降率(ESR)使用意大利ALIFAX公司生產(chǎn)的Roller 20全自動血沉儀進(jìn)行檢測；清蛋白(ALB)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、血尿酸(UA)、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4在羅氏全自動生化分析儀上進(jìn)行檢測，操作前檢查當(dāng)天室內(nèi)質(zhì)控和當(dāng)月室間質(zhì)評結(jié)果均在控，操作過程均嚴(yán)格按照儀器及配套試劑說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1各組一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 LN組、LN活動組和LN穩(wěn)定組抗dsDNA抗體、ESR、CRP、SCr、BUN及UA水平均明顯高于對照組(P<0.05)，補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4及ALB水平均明顯低于對照組(P<0.05)；LN活動組SLEDAI評分、抗dsDNA抗體、SCr、BUN及UA水平均明顯高于LN穩(wěn)定組(P<0.05)，ALB水平明顯低于LN穩(wěn)定組(P<0.05)；LN活動組和LN穩(wěn)定組補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4、ESR及CRP水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；各組間性別、年齡及體質(zhì)量指數(shù)(BMI)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

組別n補(bǔ)體C4(x±s,g/L)ALB(x±s,g/L)CRP(x±s,mg/L)SCr(x±s,μmol/L)BUN(x±s,mmol/L)UA (x±s,μmol/L)對照組500.35±0.1248.63±8.203.62±1.1547.50±8.242.15±0.84235.35±52.80LN穩(wěn)定組400.18±0.07*35.70±6.14*11.82±4.30*78.52±14.36*8.35±2.74*328.40±65.72*LN活動組780.13±0.05*27.48±5.36*#14.36±5.24*163.40±35.80*#14.26±5.38*#466.82±85.40*#LN組1180.16±0.08*30.85±5.73*12.73±4.58*128.35±22.46*11.95±4.60*417.60±72.83*F/χ24.4826.2403.9757.2186.7243.826P0.005<0.0010.014<0.001<0.0010.018

注：與對照組比較，*P<0.05；與LN穩(wěn)定組比較，#P<0.05；—為無數(shù)據(jù)。

2.2各組PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平比較 LN組、LN活動組和LN穩(wěn)定組PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平均明顯高于對照組(P<0.05)，且LN活動組PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平均明顯高于LN穩(wěn)定組(P<0.05)。見表2。

表2 各組PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平比較

2.3LN不同分型患者PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平比較 Ⅱ～Ⅲ型組、Ⅳ型組、Ⅴ～Ⅵ型組PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平均明顯高于對照組(P<0.05)；Ⅴ～Ⅵ型組和Ⅳ型組PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平均明顯高于Ⅱ～Ⅲ型組(P<0.05)。見表3。

表3 LN不同分型患者PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平比較

2.4LN不同分期患者PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平比較 晚期LN組和早期LN組PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平均明顯高于對照組(P<0.05)；晚期LN組PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平均明顯高于早期LN組(P<0.05)。見表4。

表4 LN不同分期患者PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平比較

2.5LN患者PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平與各實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，LN患者PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平與抗dsDNA抗體、SCr、BUN水平及SLEDAI評分均呈正相關(guān)(P<0.05)，與補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4及ALB水平均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與ESR、CRP及UA水平均無明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表5。

表5 LN患者PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平與各實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性

3 討 論

LN是SLE合并雙腎明顯損害的免疫性疾病，現(xiàn)常用于反映LN疾病活動度的臨床指標(biāo)包括ESR、CRP、抗dsDNA抗體、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4等，但這些指標(biāo)靈敏度和特異度不高，且檢測結(jié)果影響因素較多，尚不能成為評估LN疾病活動度及預(yù)后判斷的最佳標(biāo)志物。miRNA是一類長度為18～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，在細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞代謝和凋亡等方面發(fā)揮著重要作用，并參與機(jī)體的生理、病理過程[6]。有研究表明，miRNA能夠通過改變淋巴細(xì)胞功能，控制炎癥因子合成釋放，改變免疫細(xì)胞反應(yīng)活性或影響核因子κB、Toll樣受體等信號通路參與LN發(fā)病及病情進(jìn)展過程[7]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21及miR-423在腎臟病患者的腎組織、血液和尿液中異常表達(dá)，參與調(diào)節(jié)腎臟功能，有望成為診斷腎臟疾病的生物標(biāo)志物[8-9]。

本研究結(jié)果顯示，LN組、LN活動組和LN穩(wěn)定組PBMC中miR-21、miR-423表達(dá)水平均明顯高于對照組，且LN活動組miR-21、miR-423表達(dá)水平均高于LN穩(wěn)定組，提示PBMC中miR-21、miR-423表達(dá)水平變化與LN患者疾病活動度有關(guān)，可作為監(jiān)測LN患者疾病活動度的參考指標(biāo)。TRIONFINI等[10]研究發(fā)現(xiàn)，LN患者miRNA 表達(dá)水平明顯高于健康者，miRNA通過調(diào)控靶基因參與調(diào)節(jié)腎臟功能，并與腎臟損傷的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本研究中，LN不同分型患者PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平均明顯高于健康對照者，且Ⅴ～Ⅵ型和Ⅳ型患者PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平均明顯高于Ⅱ～Ⅲ型患者；晚期和早期LN患者PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平均明顯高于健康對照者，且晚期LN患者PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平均明顯高于早期LN患者。說明miR-21及miR-423表達(dá)水平與LN患者的病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，Ⅴ～Ⅵ型和晚期LN患者PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平升高更明顯，其可能參與了LN的發(fā)生和發(fā)展過程，有望作為監(jiān)測LN患者病情變化的參考指標(biāo)。蘇美玲等[11]研究顯示，Ⅳ+Ⅴ型LN患者血清miR-4762-5p表達(dá)水平明顯高于Ⅳ型患者和健康對照者，且與尿蛋白增加和腎臟功能受損有關(guān)，可作為鑒別LN病理類型的生物標(biāo)志物。KHOSHMIRSAFA等[12]研究發(fā)現(xiàn)，活動性腎炎組PBMC中miR-21表達(dá)水平明顯高于非活動性腎炎組和健康對照組，miR-21升高是LN發(fā)病的重要危險因素，可作為LN疾病活動度評估的生物標(biāo)志物。此外，本研究Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，LN患者PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平與抗dsDNA抗體、SCr、BUN水平及SLEDAI評分均呈正相關(guān)，與補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4及ALB水平均呈負(fù)相關(guān)。提示miR-21及miR-423表達(dá)水平與LN患者腎臟功能變化及疾病活動度有關(guān)，在LN患者疾病活動度及病情評估中具有一定的臨床價值。NAKHJAVANI等[13]的研究表明，與健康對照者相比，LN患者miR-21及miR-423表達(dá)水平明顯升高，二者參與了LN的病理、生理過程，可作為LN診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物。

4 結(jié) 論

LN患者PBMC中miR-21及miR-423表達(dá)水平明顯升高，且miR-21及miR-423表達(dá)水平升高與疾病活動度及病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可能在LN的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮一定作用，可以為早期診斷、治療和預(yù)防LN提供新的方向。