黃連解毒湯含藥血清對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細胞泡沫化TLR7信號通路的影響①

于紅紅 俞 琦 盛 蒙 陳 茜 岳文鵬 許 滔 田維毅 (貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽 550025)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種動脈內(nèi)膜炎性疾病，病變隨年齡呈漸進性，是許多心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)。由AS引發(fā)的心腦血管疾病是全球人類最主要的死亡原因之一，發(fā)病率逐年上升[1]。AS早期病變的標(biāo)志是巨噬細胞攝取氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipopro-tein，ox-LDL)，進而導(dǎo)致動脈血管壁聚集泡沫細胞、形成斑塊，從而引發(fā)AS病變的形成[2]。巨噬細胞作為重要的固有免疫細胞，不僅與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，且在AS形成的初期至斑塊破裂不穩(wěn)定期過程中起重要調(diào)控作用[3]。黃連解毒湯載于《外臺秘要》，具有瀉火解毒之功。研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯具有抗AS等作用[4，5]，其抗AS的分子機制尚未完全明了?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)已明確證實TLR7信號通路在AS中起重要作用，那么黃連解毒湯對AS的干預(yù)效果是否涉及對TLR7信號通路的調(diào)控影響炎癥因子的表達？鑒于此，本研究采用ox-LDL干預(yù)RAW264.7巨噬細胞分化為泡沫細胞，觀察了黃連解毒湯對泡沫細胞炎癥反應(yīng)以及TLR7/MyD88/NF-κB通路的干預(yù)作用，為臨床黃連解毒湯抗AS分子機制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞與動物 RAW264.7小鼠單核巨噬細胞購于上海中喬新舟有限公司。雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購于長沙市天勤生物公司,合格證號SCXK(湘)2014-0010。

1.1.2試劑 胎牛血清(美國HyClone)，ox-LDL(Sigma)，Trizol(Invitrogen)，Accutase細胞消化液(美國eBioscience)，逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa)，IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒(聯(lián)科生物)，油紅O染色試劑盒(北京索萊寶)，TLR7、MyD88、NF-κB抗體及內(nèi)參抗體(Cell signaling Technology)，BCA蛋白定量試劑盒(雅酶生物)，超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒 (美國Thermo)，HRP標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋)。

1.2方法

1.2.1制備黃連解毒湯水煎液 黃連解毒湯按原方比例配伍(黃連9 g、黃芩6 g、黃柏6 g、梔子9 g)，購自北京同仁堂貴陽店，并經(jīng)本校藥學(xué)院專家鑒定為正品。常規(guī)方法制備水煎液[6]，并加熱濃縮至含生藥1 g/ml濃度。

1.2.2黃連解毒湯含藥血清的制備 將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，取40只SD大鼠按體重采用隨機數(shù)字表法分為4組，每組10只，分別為正常組、黃連解毒湯小、中、大劑量組。參照本課題組前期實驗灌胃用藥量[7]，黃連解毒湯小、中、大劑量組分別按生藥3.5、7.0、14.0 g/(kg·d)藥液灌胃，給藥體積為1 ml/100 g(大鼠體重)；正常組灌胃生理鹽水。每日灌胃1次，連續(xù)1周。股動脈取血，分離血清，水浴滅活，微孔濾器過濾后冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3RAW264.7小鼠巨噬細胞培養(yǎng) 將RAW264.7細胞復(fù)蘇后，用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫孵育。當(dāng)細胞生長至80%～90%密度時，用Accutase消化液按1∶3 進行傳代，用對數(shù)生長期細胞做后續(xù)實驗。

1.2.4細胞分組及干預(yù)方法 實驗設(shè)為5個組，分別為正常組、模型組及黃連解毒湯小、中、大劑量組。除正常組外，其余組均建立泡沫細胞模型，即在用黃連解毒湯含藥血清干預(yù)前每孔均加入80 μg/ml的ox-LDL誘導(dǎo)24 h。光學(xué)顯微鏡鏡下觀察細胞的形態(tài)。

1.2.5油紅O染色鑒定泡沫細胞 各組細胞經(jīng)不同處理后，棄去細胞培養(yǎng)基，PBS清洗后棄液，加入多聚甲醛固定液，固定20 min；棄去固定液，PBS清洗后棄液，加入油紅O試劑進行染色，棄去染色液，加入PBS覆蓋細胞，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.6各組細胞中IL-1β、IL-6含量檢測 采用ELISA法。將細胞以5×106個/ml密度接種于96孔板中，各組細胞經(jīng)干預(yù)后，于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫孵育24 h。收集各組細胞上清。按照ELISA試劑盒說明書檢測細胞上清中IL-1β、IL-6的表達。

1.2.7各組細胞中TLR7、MyD88、NF-κB mRNA檢測 分別收集各組細胞，PBS洗滌后棄液，Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。實時熒光定量PCR儀進行擴增，檢測各目的基因，采用2-ΔΔCt方法分析計算表達量。引物序列：TLR7 上游:5′-ACGCTTTC-TTTGCAACTGTG-3′，下游：5′-TTTGTGTGCTCCTG-GACCTA-3′；MyD88上游:5′-ATAGGCACCAGCATG-CAC-3′，下游:5′-TAGGGTCCTTACCAGGTA-3′；NF-κB上游:5′-GCTACACAGAGGCCATTGAA-3′，下游:5′-TCCCGGAGTTCATCTATGTG-3′；GAPDH 上游:5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游:5′-TGTA-GACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。擴增條件：95℃ 30 s，1個循環(huán)；95℃ 5 s，55℃ 10 s，40個循環(huán)。

1.2.8各組細胞中TLR7、MyD88、NF-κB 蛋白表達 分別收集各組細胞，PBS洗滌后棄液，加入RIPA裂解細胞蛋白，取10 μl樣品用于BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，檢測出標(biāo)準(zhǔn)品和樣品吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算蛋白樣品原濃度，配平后加入蛋白上樣緩沖液。SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白分離后將膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，加入目的蛋白對應(yīng)的特異性抗體，4℃孵育過夜后，搖床洗膜，加入相應(yīng)的二抗室溫避光孵育1 h。洗滌后ECL顯影液顯影，曝光采圖保存，Image J軟件分析各目的蛋白條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1泡沫細胞模型的鑒定 顯微鏡下油紅O染色顯示：經(jīng)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細胞24 h后，細胞質(zhì)內(nèi)因存在大量脂質(zhì)顆粒而被染成紅色，呈現(xiàn)出典型的泡沫細胞形態(tài)。見圖1。

圖1 油紅O染色巨噬細胞、泡沫細胞形態(tài)

2.2對泡沫細胞IL-1β和IL-6的影響 與正常組相比較，模型組用ox-LDL干預(yù)細胞后，引起IL-1β、IL-6的高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比較，黃連解毒湯各劑量組刺激后能下調(diào)泡沫細胞上清液中IL-1β、IL-6的表達(P<0.01，P<0.05)。見表1。

表1 黃連解毒湯含藥血清對泡沫細胞上清液釋放IL-1β和IL-6的影響

2.3對泡沫細胞TLR7、MyD88、NF-κB mRNA的影響 與正常組相比，模型組TLR7、MyD88、NF-κB mRNA高表達， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)； 與模型組相比，黃連解毒湯各劑量組干預(yù)后能降低泡沫細胞TLR7、MyD88、NF-κB mRNA的表達水平(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 黃連解毒湯含藥血清對泡沫細胞TLR7、MyD88、NF-κB mRNA表達的影響

2.4對泡沫細胞TLR7、MyD88、NF-κB蛋白的影響 與正常組相比，模型組TLR7、MyD88、NF-κB 蛋白高表達(P<0.01)；與模型組相比，黃連解毒湯各劑量組干預(yù)后能降低泡沫細胞TLR7、MyD88、NF-κB蛋白的表達(P<0.05或P<0.01)。見表3、圖2。

表3 黃連解毒湯含藥血清對泡沫細胞TLR7、MyD88、NF-κB蛋白表達的影響

圖2 TLR7、MyD88、NF-κB蛋白表達電泳

3 討論

AS發(fā)展過程為動脈內(nèi)膜首先受累，進而纖維組織增生，動脈管壁增厚變硬，血管腔狹窄[1]。巨噬細胞是AS發(fā)生和發(fā)展的核心細胞，巨噬細胞滲入血管內(nèi)皮下的低密度脂蛋白發(fā)生氧化修飾形成ox-LDL，隨后通過相關(guān)受體吞噬ox-LDL及其他經(jīng)過修飾的脂蛋白，致使細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，進而發(fā)展成泡沫細胞[8]。在具有炎癥的動脈內(nèi)膜中，巨噬細胞源性泡沫細胞大量積聚一直被認為是AS病變的標(biāo)志。炎癥與AS存在密切聯(lián)系，控制炎癥有助于靶向治療AS[9]。

黃連解毒湯具有清熱解毒作用，近些年來許多醫(yī)家用黃連解毒湯治療AS取得顯著效果。前期課題組實驗證實，黃連解毒湯可抑制AS斑塊形成及進展，分析與調(diào)節(jié)巨噬細胞自噬與極化、抑制炎癥因子過表達、減少相關(guān)活性物質(zhì)分泌等有關(guān)[7，10]。另有研究表明，黃連解毒湯可通過抗氧化、降脂、保護血管內(nèi)皮細胞等方面發(fā)揮抗AS作用[4,5]，但其抗AS作用機制尚未完全清楚。近年來，越來越多的資料顯示Toll 樣受體(toll-like receptors，TLR) 參與了AS疾病的研究，為AS 的防治提供了新的靶點及選擇[11]。TLR7 是表達于哺乳動物細胞內(nèi)的Ⅰ型跨膜蛋白受體。TLR7主要通過MyD88信號依賴型途徑活化免疫細胞，最終通過NF-κB和MAPK兩條途徑介導(dǎo)信號傳導(dǎo)，從而調(diào)控促炎細胞因子的釋放，如TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1等，參與AS進展的整個過程[12]。研究資料顯示在人的AS斑塊中發(fā)現(xiàn)TLR1、2、4、7 的 mRNA 表達顯著升高；在人股動脈粥樣硬化斑塊的中期、晚期均發(fā)現(xiàn) TLR7 mRNA 及蛋白的表達顯著升高[12,13]。

實驗結(jié)果表明，ox-LDL干預(yù)細胞后可激活TLR7/MyD88/NF-κB信號通路、促進IL-1β、IL-6炎癥因子產(chǎn)生，黃連解毒湯可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的TLR7、MyD88、NF-κB表達，并下調(diào)炎癥因子IL-1β、IL-6的表達，部分干預(yù)作用呈現(xiàn)出劑量依賴性。本實驗發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯可通過調(diào)節(jié)TLR7/MyD88/NF-κB通路抑制ox-LDL干預(yù)的RAW264.7源性泡沫細胞炎癥反應(yīng)，為清熱解毒類方劑干預(yù)AS的相關(guān)分子機制研究提供了新思路。