miR-19b過表達抑制阿霉素誘導的H9c2心肌細胞凋亡

周 琦 劉 敏 駱春艷 明 強 (同濟天佑醫(yī)院心血管內科，武漢 461000)

阿霉素(doxorubicin，DOX)是一種蒽環(huán)類抗生素，臨床上用于多種癌癥的治療[1]。但治療過程中DOX會引發(fā)多種不良反應，其中心臟毒性最為常見[1，2]。DOX引起的心臟損傷臨床表現為左心室收縮功能降低，最終導致心力衰竭[3]。其誘導的心臟毒性的確切機制尚未完全闡明。許多研究證實DOX誘導的心臟毒性與大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成和Caspase-3激活有關[4，5]。

MicroRNA(miRNA)是一種在進化上高度保守的內源性非編碼RNA，長度約20～25個核苷酸，與多種疾病密切相關，其中包括自身免疫性疾病以及腫瘤等。除此之外，miRNA在心臟疾病領域中的研究也日益深入[6，7]。miR-19b是miRNA家族成員之一，大量研究表明miR-19b參與心臟的早期發(fā)育過程，同時參與包括心肌梗死、病毒性心肌炎等在內的多種心血管疾病的發(fā)展過程[8]，但其在DOX誘導的心臟毒性方面的研究較少。本研究通過調控miR-19b在DOX誘導后的H9c2心肌細胞中的表達，探討miR-19b對DOX誘導的心肌細胞損傷的影響，以期為減少DOX對心臟的毒副作用提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠心肌細胞系H9c2(中國科學院細胞庫)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；miR-19b mimic/inhibitor序列(廣州瑞博生物技術有限公司)；Trizol總RNA提取試劑盒(Ambion公司)；Advantage RT-PCR反轉錄試劑盒(寶生物工程有限公司)；SYBR Green PCR試劑盒(KAPA Biosystems公司)；MTT、RIPA(強)組織細胞快速裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、PBS緩沖液、兔抗Bad抗體、兔抗Bcl-2抗體、兔抗Caspase-3抗體、兔抗GAPDH抗體、羊抗兔IgG抗體、ROS檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒(武漢華聯科生物技術有限公司)；兔抗Caspase-9、兔抗細胞色素C(Cytochrome C，Cyt-C)抗體、兔抗p53抗體(Abcam公司)；ATP含量檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組 大鼠心肌細胞H9c2于DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清+100 U/ml青霉素+ 100 U/ml鏈霉素)中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞密度達90%時用0.25%胰酶消化、傳代。

取對數期生長狀況良好的細胞，分成6組：①空白對照組(Control組)：H9c2細胞正常培養(yǎng)；②DOX組：250 ng/ml DOX處理H9c2細胞[9]；③mimic NC組：H9c2細胞經250 ng/ml DOX處理24 h后，轉染miR-19b mimic NC；④inhibitor NC組：H9c2細胞經250 ng/ml DOX處理24 h后，轉染miR-19b inhibitor NC；⑤miR-19b mimic組：H9c2細胞經250 ng/ml DOX處理24 h后，轉染miR-19b mimic；⑥miR-19b inhibitor組：H9c2細胞經250 ng/ml DOX處理24 h后，轉染miR-19b inhibitor。

1.2.2MTT法檢測細胞活性 采用MTT實驗檢測250 ng/ml DOX處理12、24、48 h后H9c2細胞的活性，確定DOX的處理時間。將對數期細胞接種于96孔板中，180 μl/孔，細胞濃度為5×103個/孔，37℃培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁。加入DOX分別培養(yǎng)12、24、48 h后取出孔板，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，37 ℃培養(yǎng)4 h。棄上清，加入150 μl二甲亞砜，振蕩10 min，在490 nm波長處檢測各孔吸光度。

1.2.3細胞轉染 取對數生長期細胞接種于培養(yǎng)皿中，當細胞70%融合時，采用DOX處理細胞 24 h，隨后根據LipofiterTM2000轉染試劑盒說明書，分別轉染miR-19b mimic和miR-19b inhibitor以及對應的陰性對照，37 ℃培養(yǎng)6 h后換新鮮培養(yǎng)基。

1.2.4RT-PCR檢測miR-19b的表達 轉染24 h后，采用Trizol法提取各組細胞中總RNA，隨后將RNA反轉錄成cDNA。以cDNA為模板，分別擴增U6和miR-19b。U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′；miR-19b上游引物：5′-GGGTGTGCAAATCCATGC-3′，下游引物：5′-AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′。反應程序為：95 ℃預變性3 min；95℃變性5 s，56℃退火10 s，72℃延伸25 s，共39個循環(huán)；65℃延伸5 s。

1.2.5流式細胞術檢測ROS水平 轉染24 h后根據ROS檢測試劑盒說明書進行操作。DCFH-DA稀釋至10 μmol/L，將處理后的各組細胞懸浮于其中，細胞密度為1×107個/ml，37℃孵育20 min，每隔4 min 顛倒混勻1次。收集各組細胞，流式細胞儀檢測ROS水平。

1.2.6流式細胞術檢測線粒體膜電位 轉染24 h后取10萬～60萬細胞重懸于0.5 ml細胞培養(yǎng)液中，加入0.5 ml JC-1染色液，混勻后37 ℃ 孵育20 min。600 μg，4 ℃離心4 min，棄上清。1 ml JC-1染色液重懸細胞，600 μg，4 ℃離心4 min，棄上清(重復2次)。用JC-1染色液重懸細胞，流式細胞儀檢測線粒體膜電位。

1.2.7ATP水平檢測 轉染24 h后根據ATP含量檢測試劑盒說明書進行操作，在636 nm波長處檢測各孔吸光度。

1.2.8Western blot檢測凋亡相關蛋白表達 轉染24 h后，收集各組細胞提取總蛋白，蛋白采用BCA試劑盒定量后經SDS-PAGE電泳分離，再將蛋白轉印至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加入一抗稀釋液(Bad，Bcl-2，Caspase-9，Caspase-3，Cyt-C，p53，GAPDH)，室溫孵育1 h。PBS洗滌3次，每次5 min，加入二抗稀釋液(HRP標記的IgG)，室溫孵育1 h。PBS洗滌3次，每次5 min，加入化學發(fā)光試劑，全自動化學發(fā)光分析儀檢測。GAPDH為內參。

2 結果

2.1DOX 抑制H9c2心肌細胞增殖 與對照組相比，H9c2心肌細胞的活性隨著DOX作用時間的增長逐漸降低(圖1)；當DOX處理細胞12 h后，細胞存活率無差異無統計學意義(P>0.05)；處理24 h后，細胞存活率差異有統計學意義(P<0.05)；處理48 h后細胞存活差異也有統計學意義(P<0.05)，但毒副作用較大；因此，后續(xù)實驗DOX的處理時間選用24 h。

圖1 DOX降低H9c2心肌細胞活性

2.2miR-19b mimic/inhibitor明顯改變H9c2心肌細胞中miR-19b的表達量 與對照組相比，DOX組細胞中miR-19b的表達量降低(P<0.05)。與DOX組相比，mimic NC組和inhibitor NC組miR-19b的表達量無明顯變化；miR-19b inhibitor 組miR-19b的表達量明顯降低(P<0.05)，而miR-19b mimic 組miR-19b的表達量明顯升高(P<0.05)，見圖2。

圖2 轉染后H9c2心肌細胞中miR-19b的表達情況

2.3miR-19b過表達抑制DOX誘導H9c2心肌細胞ROS的產生 與DOX組比較，mimic NC組和inhibitor NC組細胞中ROS的產生無明顯變化；miR-19b inhibitor組細胞中ROS的產生增多；miR-19b mimic 組細胞中ROS的產生減少，見圖3。

圖3 DOX對H9c2心肌細胞中ROS表達的影響

2.4miR-19b過表達抑制DOX誘導后H9c2心肌細胞線粒體膜電位的降低 與DOX組比較，mimic NC組和inhibitor NC組中處于正常線粒體膜電位的細胞比例無明顯變化；miR-19b inhibitor組中線粒體低電位細胞比例增多；miR-19b mimic組中線粒體低電位細胞比例減少，見圖4。

圖4 DOX對H9c2心肌細胞線粒體膜電位情況的影響

2.5miR-19b過表達提高DOX誘導后H9c2心肌細胞中ATP含量 與DOX組比較，mimic NC組和inhibitor NC組細胞中ATP的含量無明顯變化；miR-19b inhibitor組細胞中ATP的含量降低(P<0.05)；miR-19b mimic組細胞中ATP的含量升高(P<0.05)，見圖5。

圖5 DOX對H9c2心肌細胞中ATP含量的影響

2.6miR-19b過表達抑制H9c2心肌細胞凋亡 與DOX組比較mimic NC組和inhibitor NC組細胞中Bad、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3、Cyt-C和p53蛋白的表達水平無明顯變化；miR-19b inhibitor組細胞中Bad、Caspase-9、Caspase-3、Cyt-C和p53蛋白的表達水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平降低(P<0.05)；miR-19b mimic組細胞中Bad、Caspase-9、Caspase-3、Cyt-C和p53蛋白的表達水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平升高(P<0.05)，見圖6。

圖6 DOX對H9c2心肌細胞中凋亡相關蛋白的表達的情況影響

3 討論

DOX可以顯著提高癌癥患者的生存率，但是DOX引發(fā)的心臟毒性，并伴隨左心室功能障礙和心力衰竭，嚴重影響了癌癥患者的生活質量[10]。越來越多的證據表明，ROS的過量產生參與DOX誘導的心臟毒性過程，過量產生的ROS引起氧化損傷和心肌細胞凋亡，最終導致心力衰竭[11]。心肌細胞凋亡在DOX誘導的慢性心肌毒性過程中起重要作用[12，13]。體內和體外實驗均表明，DOX誘導產生的ROS可導致心肌細胞凋亡，這可能與ROS導致DNA損傷、線粒體功能障礙、蛋白質合成抑制及細胞膜結構和功能破壞有關[5，14，15]。

線粒體是產生ROS的主要細胞器，也是ROS誘導氧化損傷的重要靶點，并在能量生產、細胞生長和凋亡誘導等多種生物學功能中發(fā)揮重要作用[16-18]。ROS誘導線粒體損傷主要是通過調控線粒體蛋白、線粒體脂質體和線粒體DNA的改變實現的[19]。p53是重要的抑癌基因，同時參與細胞凋亡的調控。當ROS誘導DNA發(fā)生嚴重損傷且無法修復時，p53可以通過增加Bax蛋白的表達或促使Bcl-2蛋白失活對細胞凋亡進行調節(jié)[20]。Bax和Bcl-2均屬于Bcl-2家族蛋白，該家族蛋白是一類可以通過調節(jié)線粒體膜通透性從而調控細胞凋亡的蛋白質。Bax的激活表達和Bcl-2的抑制可促進線粒體通透性轉變孔的打開，從而導致Cyt-C從線粒體釋放進入細胞質，進而激活Caspase-9及其下游因子Caspase-3，誘導細胞凋亡[20]。Bad是Bcl-2家族的另外一種蛋白，在促進線粒體相關凋亡中同樣起重要作用[21]。ATP是生物體最直接的能量來源，主要由線粒體產生。上調ATP水平，可以抑制心肌細胞線粒體中Cyt-C的釋放，緩解ROS誘導的線粒體損傷[22]。

研究表明，miR-19b在心肌炎患者血漿中低表達，過表達miR-19b可以明顯提高心肌細胞的存活率，抑制心肌細胞凋亡[23]。本研究發(fā)現，DOX可下調H9c2心肌細胞中miR-19b的表達，上調DOX誘導后的H9c2心肌細胞中miR-19b的表達，可以抑制心肌細胞中ROS的產生，降低細胞線粒體膜電位下降的細胞比例，同時抑制Bad、Caspase-9、Caspase-3、Cyt-C和p53蛋白的表達，促進Bcl-2蛋白的表達；而miR-19b抑制與miR-19b過表達的作用相反。

綜上所述，miR-19b過表達能緩解DOX誘導的心肌細胞損傷，其機制可能與抑制ROS產生及線粒體相關凋亡有關，這為減少DOX對心臟的毒副作用方面研究提供研究思路。