參菊洗劑抗炎作用機(jī)制的研究

張廣求， 張美祥， 譚 璐

(黃岡市中心醫(yī)院藥劑科； 長(zhǎng)江大學(xué)黃岡臨床醫(yī)學(xué)院， 湖北 黃岡 438000)

參菊洗劑是黃岡市中心醫(yī)院根據(jù)臨床驗(yàn)方研制的中藥外用洗劑，主要由苦參、野菊花、黃柏、蛇床子等中藥組成，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、殺蟲(chóng)止癢功效，用于濕毒所致的細(xì)菌性、真菌性、滴蟲(chóng)性陰道炎及皮膚瘙癢癥的治療，具有較好的臨床療效[1-2]。本課題組前期對(duì)參菊洗劑的體外抑菌、抗過(guò)敏、殺蟲(chóng)止癢作用及皮膚刺激性、急性毒性等進(jìn)行了研究[3-6]。 本研究采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹、醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加、角叉菜膠致大鼠足跖腫脹3種炎癥模型，探究參菊洗劑的抗炎作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥參菊洗劑(含生藥量為0.54 g/mL，黃岡市中心醫(yī)院藥劑科自制，批準(zhǔn)文號(hào)：鄂藥制字Z20180800，批號(hào)：180328，180415，180502)，潔爾陰洗液(含生藥量為1 g/mL，四川恩威制藥有限公司，批號(hào)：1704003)，0.9%氯化鈉注射液(武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：170401-0504)，硫化鈉(天津大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：201700916)，乙醚(天津市天力化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180322)，二甲苯(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20160216)，伊文思藍(lán)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150729)，冰醋酸(廣州市番禺力強(qiáng)化工廠，批號(hào)：20170615)，角叉菜膠(美國(guó)SIGMA公司，批號(hào)：SLBK3896V)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20180322)，丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20180328)，前列腺素E2(PGE2)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)：20180519)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)：20180428)。

1.2 儀器ZH-YLS-Q4型鼠耳打孔器(原陽(yáng)縣振華教學(xué)儀器有限公司)，YLS-7B型足跖容積測(cè)量?jī)x(濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司)，AL104型電子天平[梅特勒托利多儀器(上海)有限公司]，Allegra 64R型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)BECKMAN公司)，F(xiàn)SH-2A型可調(diào)高速勻漿機(jī)(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)，TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，T6型新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)，Multiskan FC型酶標(biāo)儀[賽默飛世爾(上海)儀器有限公司]，HS-80TW-1DF型電子秒表(深圳市博迅達(dá)電子科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物KM小鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)買于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2017-0012。SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20) g，購(gòu)買于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0018。所有動(dòng)物均自由攝食和飲水，在室溫度(20～26)℃，相對(duì)濕度40%～70%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)5～7 d。動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(鄂)2014-0083。本實(shí)驗(yàn)方案及操作均符合醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 抗二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)[7]取小鼠50只，雌雄各半，用乙醚麻醉，分別在小鼠右耳廓前后兩面均勻涂布20 μL二甲苯，致炎后隨機(jī)分為5組：參菊洗劑低、中、高劑量組(參菊洗劑0.054、0.108、0.216 g/mL)，陽(yáng)性對(duì)照組(10%潔爾陰洗液，0.1 g/mL)，模型對(duì)照組(0.9%氯化鈉注射液)，每組10只。另取小鼠10只，雌雄各半，不進(jìn)行任何處理作為空白對(duì)照組。在致炎后0.5、1.0、2.0 h分別在各組小鼠右耳廓炎癥部位涂抹相應(yīng)藥物，每次50 μL，各組小鼠左耳不作任何處理。致炎4 h后用乙醚淺表麻醉小鼠，頸椎脫臼處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用鼠耳打孔器于左、右耳相同部位取下圓形耳片，用電子天平稱取質(zhì)量，以同一只小鼠兩耳片質(zhì)量差為腫脹度，計(jì)算各組小鼠耳腫脹度和腫脹抑制率，耳腫脹度=右耳片質(zhì)量/mg-左耳片質(zhì)量/mg；腫脹抑制率/%=[(模型對(duì)照組腫脹度均值-給藥組腫脹度均值)/模型對(duì)照組腫脹度均值]×100%。

1.4.2 抗醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)[8]取小鼠50只，雌雄各半，每只小鼠腹部同一部位各脫毛2 cm×3 cm，隨機(jī)分為5組，每組10只,分別為：參菊洗劑低、中、高劑量組(參菊洗劑0.054、0.108、0.216 g/mL)，陽(yáng)性對(duì)照組(10%潔爾陰洗液，0.1 g/mL)，模型對(duì)照組(0.9%氯化鈉注射液)。脫毛24 h后，分別在各組小鼠脫毛區(qū)均勻涂抹相應(yīng)藥物，每次0.1 mL，每天2次，連續(xù)3 d。末次給藥30 min后，于小鼠尾靜脈注射含0.5%伊文思藍(lán)的0.9%氯化鈉注射液0.2 mL，腹腔注射0.7%醋酸溶液0.2 mL致炎，20 min后，用乙醚淺表麻醉小鼠，頸椎脫臼處死，腹腔注射0.9%氯化鈉注射液6 mL，反復(fù)輕柔腹部20次，吸出腹腔液于3 000 r/min (r=10 cm)離心5 min，取上清液，用分光光度計(jì)測(cè)定590 nm處的吸光度，計(jì)算腹腔毛細(xì)血管通透性抑制率。腹腔毛細(xì)血管通透性抑制率/%= [(模型對(duì)照組平均吸光度-給藥組平均吸光度)/模型對(duì)照組平均吸光度]×100%。

1.4.3 抗角叉菜膠致大鼠足跖腫脹實(shí)驗(yàn)[9]取后肢足跖正常無(wú)損傷的大鼠50只，雌雄各半，將大鼠右后下肢外側(cè)脫毛處理，分別測(cè)定右后足跖體積，作為致炎前的足跖體積。將大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為：參菊洗劑低、中、高劑量組(參菊洗劑0.054、0.108、0.216 g/mL)，陽(yáng)性對(duì)照組(10%潔爾陰洗液，0.1 g/mL)，模型對(duì)照組(0.9%氯化鈉注射液)。將各組大鼠右后足跖分別置于相應(yīng)藥液中浸泡180 s，各組大鼠分別于1、2 h后右后足跖中部皮下注射1%角叉菜膠混懸液(用0.9%氯化鈉注射液配制)0.1 mL致炎，測(cè)量各組大鼠致炎后1、2、3、4 h時(shí)右后足跖體積。以大鼠致炎前、后足跖體積的差值為腫脹度，比較各組大鼠足跖腫脹度的差異，腫脹度/mL=致炎后足跖體積-致炎前足跖體積。

1.4.4 對(duì)炎癥大鼠血清和足跖組織中SOD、MDA、PGE2、TNF-α的影響 將“1.4.3”項(xiàng)下測(cè)量給藥后4 h足跖體積的大鼠用乙醚麻醉，摘眼球取血，頸椎脫臼處死。全血靜置30 min后，3 000 r/min (r=10 cm)離心10 min，取上層血清，置于4℃冰箱中冷藏，備用。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分別測(cè)定血清中MDA、PGE2、TNF-α水平和SOD活性。在踝關(guān)節(jié)處剪下各組大鼠右后足跖，稱定質(zhì)量后剪碎，以4℃預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液制成10%組織勻漿，4℃下3 000 r/min (r=10 cm)離心10 min，取上清液，置于4℃冰箱中冷藏，備用。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分別測(cè)定足跖組織中MDA、PGE2、TNF-α水平和SOD活性。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹抑制率的影響與模型對(duì)照組比較，參菊洗劑各劑量和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠腫脹抑制率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01～0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，菊洗劑高劑量組小鼠腫脹抑制率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 參菊洗劑對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

2.2 對(duì)醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響與模型對(duì)照組比較，參菊洗劑各劑量和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性抑制率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01～0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，菊洗劑高劑量組小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性抑制率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 參菊洗劑對(duì)醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

2.3 對(duì)角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響與模型對(duì)照組比較，參菊洗劑各劑量和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠在致炎后1、2、3、4 h大鼠足跖腫脹度均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01～0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，參菊洗劑高劑量組在致炎后1、2、3、4 h大鼠足跖腫脹度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 參菊洗劑對(duì)角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響

2.4 對(duì)炎癥大鼠血清和足跖組織中SOD、MDA、PGE2、TNF-α水平的影響與模型對(duì)照組比較，參菊洗劑各劑量和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清中SOD水平升高，MDA和TNF-α水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01～0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，參菊洗劑中、高劑量組大鼠血清中SOD水平升高，參菊洗劑高劑量組大鼠血清中MDA和TNF-α水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表4。與模型對(duì)照組比較，參菊洗劑各劑量和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠足跖組織中SOD水平升高，MDA、PGE2和TNF-α水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01～0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，參菊洗劑中、高劑量組大鼠足跖組織中SOD水平升高，參菊洗劑高劑量組大鼠足跖組織中MDA和TNF-α水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表5。

表4 參菊洗劑對(duì)大鼠血清中SOD、MDA、PGE2、TNF-α水平的影響

表5 參菊洗劑對(duì)大鼠足跖組織中SOD、MDA、PGE2、TNF-α水平的影響

3 討論

炎癥是臨床較常見(jiàn)的病理生理過(guò)程，是機(jī)體對(duì)有害刺激所產(chǎn)生的復(fù)雜的防御反應(yīng)，在該過(guò)程中，巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞釋放的PGE2、TNF-α等多種炎癥因子都有參與。炎癥的發(fā)展一般分為早、中、晚三期，急性炎癥或炎癥早期的主要表現(xiàn)是毛細(xì)血管擴(kuò)張、通透性增加、滲出和水腫，中期表現(xiàn)為血小板吸附及白細(xì)胞游走，晚期為肉芽組織增生[10]。SOD是生物體內(nèi)重要的內(nèi)源性活性蛋白酶，能催化超氧化物自由基分解，清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)和抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生引起的炎癥反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞、組織免受氧化損傷，有效抵抗氧自由基對(duì)機(jī)體的傷害[11-12]。炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基，攻擊細(xì)胞膜、線粒體膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，形成過(guò)氧化脂質(zhì)，進(jìn)一步分解為MDA。測(cè)定MDA的水平，可反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度及細(xì)胞受自由基攻擊的程度[13]。PGE2是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，是一種活性很強(qiáng)的炎癥因子，具有擴(kuò)張血管、致熱、致痛等生物活性，可通過(guò)加強(qiáng)組胺及緩激肽的效應(yīng)而引起血管通透性增強(qiáng)、加強(qiáng)其他趨化因子的作用而使白細(xì)胞向炎區(qū)聚集，從而引起水腫、充血、局部紅斑等炎癥反應(yīng)。本研究表明，參菊洗劑能明顯降低大鼠足跖炎癥組織中PGE2含量，但各組大鼠血清PGE2含量均未有顯著變化。可能是由于血清PGE2主要來(lái)源于血管內(nèi)皮細(xì)胞和血小板，在炎癥反應(yīng)過(guò)程中未受到明顯刺激，故血清PGE2的含量就沒(méi)有明顯變化；而足跖炎癥組織因致炎物質(zhì)角叉菜膠的刺激使PGE2合成增多。因此，抗炎藥能抑制局部組織中PGE2合成發(fā)揮抗炎作用，而對(duì)血清中PGE2含量無(wú)明顯影響[14]。TNF-α是炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，通過(guò)誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)，特別是T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和組織損傷；同時(shí)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，使之分泌趨化性細(xì)胞因子，從而趨化單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞，并刺激其活化，釋放出多種炎癥因子，引起炎癥反應(yīng)[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，參菊洗劑對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹、醋酸致小鼠毛細(xì)血管通透性增加和角叉菜膠致大鼠足跖腫脹均有良好的抑制作用，其抗炎機(jī)制與提高SOD活性，增強(qiáng)清除自由基能力，抑制脂質(zhì)體過(guò)氧化和MDA、PGE2、TNF-α等炎癥因子的合成與釋放有關(guān)。證實(shí)參菊洗劑外用具有較好的抗炎作用，為其臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。