• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    2株鵪鶉H9N2亞型流感病毒的分離鑒定

    2020-09-28 08:23:56范春艷宋金祥薛素琴唐爭魁孫惠霞馬興樹王順山
    中國獸醫(yī)雜志 2020年4期
    關(guān)鍵詞:尿囊傳代鵪鶉

    范春艷,宋金祥,薛素琴,唐爭魁,孫惠霞,喬 健,馬興樹,王順山

    (1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193;2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,河北 邯鄲 056002;3.河北省張北縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所,河北 張北 076450;4.河北省邯鄲市肉雞場,河北 邯鄲 056000;5.河北省邯鄲市邯山區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,河北 邯鄲 056000;6.北京生泰爾科技股份有限公司,北京 大興 102600)

    禽流感(Avian influenza,AI)是由正黏病毒科A型流感病毒中有致病性的任何一型毒株引起各種家禽及野鳥的一種傳染性疾病綜合征,受感染的禽類可呈現(xiàn)臨床癥狀,如輕度上呼吸道疾病,產(chǎn)蛋率、受精率及孵化率下降,甚至急性全身致死性疾病[1]。疾病的嚴重程度取決于病毒毒株的毒力、感染禽種、年齡、性別、有無并發(fā)癥及環(huán)境條件等。迄今為止,已鑒定的A型流感病毒(Avian influenza virus,AIV)表面主要糖蛋白血凝素(HA)為18種(H1~H18)、神經(jīng)氨酸酶(NA)為11種(N1~N11),其中H1~H16和N1~N9均可自禽類分得[2],H17N10和H18N11則發(fā)現(xiàn)于蝙蝠[3-4]。H9N2亞型屬于低致病性AIV(LPAIV),但自1992年我國首次發(fā)現(xiàn)后[5],現(xiàn)已成為我國主要流行的亞型,分布廣泛,具有跨宿主傳播特點,且有可能產(chǎn)生遺傳特性及抗原特性完全不同的新型流感病毒風(fēng)險[6]。近年來,隨著我國鵪鶉飼養(yǎng)數(shù)量的逐年增多,多種亞型AIV對鵪鶉養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展已構(gòu)成嚴重威脅[7],有資料表明,鵪鶉在流感病毒生態(tài)系統(tǒng)中可作為一個重要的中間宿主[8-9]。因此,對鵪鶉流感病毒的監(jiān)控具有重要公共衛(wèi)生意義。2006-2014年,對河北省部分養(yǎng)殖場病死鵪鶉采集的氣管拭子樣品23份,通過病毒分離、血凝試驗(HA)、血凝抑制(HI)試驗及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)鑒定出2株H9N2流感病毒?,F(xiàn)將鑒定結(jié)果報告如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 病料與雞胚 病料為采集于河北省部分養(yǎng)殖場病死鵪鶉的氣管分泌物。9~12日齡SPF雞胚,購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。

    1.1.2 陽性血清 雞新城疫病毒血凝抑制試驗陽性血清,購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;禽流感病毒H9亞型、H5亞型(Re-6、Re-7及Re-8)及H7亞型(H7N9株)陽性血清,均購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

    1.1.3 試劑盒 MiniBEST病毒RNA/DNA提取試劑盒 (MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0)、一步法RT-PCR試劑盒[PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus)],均購自TaKaRa公司。

    1.2 方法

    1.2.1 樣品的采集與處理 2006-2014年,自有呼吸道癥狀、臉腫、下痢(黃綠色稀水樣糞便)、鵪鶉產(chǎn)蛋率下降、死亡率較高的病死鵪鶉的氣管中,用滅菌棉拭子蘸取適量硫酸慶大霉素注射液(8萬IU/mL),無菌條件下擦拭病死鵪鶉的氣管分泌物,制成氣管拭子。將氣管拭子置于備有2 mL采樣液(硫酸慶大霉素注射液)的滅菌離心管中充分混勻,并將拭子頭在滅菌的離心管壁上反復(fù)擠壓數(shù)次,然后12 000 r/min離心2 min,取上清液經(jīng)直徑0.22 μm的微孔細菌濾器除菌,濾液備用[1]。

    1.2.2 病毒分離培養(yǎng) 采用雞胚接種法[1]。取上述處理備用的樣品0.1~0.2 mL接種于10~12日齡SPF雞胚尿囊腔,每一樣品接種5枚雞胚。于37 ℃、56%濕度條件下在孵育箱中孵育2~3 d。棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚,收集24~72 h的雞胚尿囊液。收獲的尿囊液分別滴3~4滴于大孔塑料版的不同孔中,加等量的1%雞紅細胞,搖勻后靜置于4 ℃ 30 min觀察結(jié)果,如出現(xiàn)血凝,則可進一步測定血凝滴度并鑒定。如血凝陰性,按上述方法盲傳3代,如仍為陰性,則棄之。

    1.2.3 病毒初步鑒定 采用血凝(HA)與血凝抑制(HI)試驗。對具有血凝性的病毒,分別與新城疫(Newcastle disease,ND)陽性血清及H9、H5(Re-6、Re-7、Re-8)及H7(H7N9株)禽流感陽性血清進行HI試驗。

    1.2.4 病毒的雞胚傳代 采用雞胚接種法[1]傳代,共傳5代。第1代雞胚尿囊液為氣管拭子的處理樣品接種SPF雞胚收獲的病毒尿囊液。第1~4代病毒尿囊液采用2種方法進行雞胚傳代培養(yǎng)。一種方法是直接用上一代病毒尿囊液原液接種SPF雞胚尿囊腔;另一種方法是將上一代雞胚尿囊液配制為4個凝集單位的病毒液,然后接種SPF雞胚尿囊腔。接種培養(yǎng)后,均采用HA試驗測定1~5代雞胚尿囊液的血凝效價,對2種接種方法進行比較。

    1.2.5 病毒RNA提取 按照MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒說明書進行。

    1.2.6HA、NA基因的RT-PCR擴增及序列測定 根據(jù)文獻報道的HA和NA引物序列[10],由寶生物工程(大連)有限公司合成。HA引物序列(F:5′-AGC AAA AGC AGG GGA ATT TCA C-3′;R:5′-AGT AGA AAC AAG GGT GTT TTT GC-3′)和NA引物序列(F:5′-AGC AAA AGC AGG AGT AAA AAT G-3′;R:5′-AGT AGA AAC AAG GAG TTT TTT-3′)。

    參照PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒說明書進行RT-PCR擴增:50 ℃ 30 min;94 ℃ 2 min;35個循環(huán):94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min;72 ℃ 10 min;4 ℃終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后,送北京華大基因科技服務(wù)有限公司測序。

    1.2.7 基因序列同源性分析 采用NCBI在線HA和NA基因序列BLAST分析。

    2 結(jié)果

    2.1 采樣鵪鶉群的發(fā)病情況調(diào)查 2006-2014年共從23個疑似發(fā)生流感的鵪鶉養(yǎng)殖場進行了樣品采集。疑似發(fā)生流感的鵪鶉群發(fā)病情況基本類似,但臨床表現(xiàn)及病理剖檢變化輕重不一。不同日齡的鵪鶉均可發(fā)生,基本是在禽流感疫苗免疫3月以上或未免疫禽流感疫苗的鵪鶉群發(fā)生。臨床癥狀綜合表現(xiàn)為下列現(xiàn)象:鵪鶉發(fā)病率和死亡率約為20%~100%,其中某些鵪鶉群發(fā)病率約為20%左右,幾乎無死亡。鵪鶉產(chǎn)蛋量下降到60%以下?;疾※g鶉精神沉郁、呆立一隅,食欲減少,羽毛蓬亂;嚴重者低頭縮頸、閉眼、打盹,站立不穩(wěn),或頭頸歪邪、頭縮于翅下,或蹲臥于籠中,食欲廢絕,排出黃綠色或白色水樣、黏液樣糞便;最嚴重者肢體無力,蹲臥不起。病死鵪鶉剖檢可見,氣管內(nèi)有黏性分泌物或稀軟奶酪樣物質(zhì),有的氣管出血,有的氣管無出血;腺胃與食道交界處出血,腺胃腫脹,內(nèi)膜覆蓋厚厚一層黏稠分泌物,腺胃乳頭出血;十二指腸等腸道腫脹,內(nèi)有黏性分泌物,腸道黏膜斑塊狀出血;胰腺出血;心冠脂肪出血;輸卵管內(nèi)有黏稠分泌物,嚴重的卵泡變形、破裂,腹腔內(nèi)有破裂的新鮮卵黃等。

    2.2 病毒的初步鑒定 2006-2014年共采集不同日齡病死鵪鶉氣管拭子23份,除1個樣品經(jīng)雞胚尿囊腔接種盲傳3代仍無血凝外,其他22份樣品的雞胚尿囊液的血凝滴度均在5Log2以上(表1)。經(jīng)HI試驗鑒定發(fā)現(xiàn),其中2009年分離的Qa/LC04/09毒株、2011年分離的Qa/LC02/11毒株和Qa/LC04/11為ND陽性病毒,除2008年分離的Qa/LC02/08毒株和2011年分離的Qa/LC01/11毒株為H9N2陽性外,其余樣品均為H5亞型陽性AIV(表1)。

    表1 雞胚尿囊液HA和HI試驗結(jié)果Table 1 HA and HI titre of the allantoic fluid from chick embryos

    2.3 鵪鶉H9N2流感病毒的雞胚傳代血凝性分析 Qa/LC02/08和Qa/LC01/11毒株的氣管拭子樣品經(jīng)SPF雞胚接種后,收獲的第1代雞胚尿囊液的HA滴度均為5Log2。雞胚尿囊液原液傳代的第2代雞胚尿囊液的HA滴度升高,分別為8Log2和9Log2,第3代雞胚尿囊液的HA滴度均下降為6Log2,第4代HA滴度下降為4Log2和5Log2。但傳代時先將上一代病毒尿囊液稀釋為4個血凝單位病毒尿囊液,然后再接種9~12日齡SPF雞胚尿囊腔,則收獲的下一代病毒尿囊液的HA滴度均能達到8Log2以上(表2)。結(jié)果表明,在流感病毒采用SPF雞胚傳代時,不應(yīng)使用未經(jīng)稀釋的高濃度的病毒尿囊液進行雞胚接種傳代,而應(yīng)將其稀釋為4個血凝單位后,再接種SPF雞胚才能使收獲的病毒尿囊液的HA滴度升高。

    表2 不同雞胚傳代次數(shù)的尿囊液HA試驗結(jié)果(Log2)Table 2 HA titre of the different passages of the allantoic fluid from chick embryos (Log2)

    2.4 RT-PCR產(chǎn)物的凝膠電泳鑒定 采用發(fā)表文獻的HA和NA引物序列合成相應(yīng)的引物,經(jīng)RT-PCR擴增出H9和N2目的條帶(圖1)。2株H9N2 AIV分別命名為A/Quail/Hebei/LC02/2008(H9N2)(簡稱為Qa/LC02/08)和A/Quail/Hebei/LC01/2011(H9N2)(簡稱為Qa/LC01/11)。

    圖1 RT-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The electrophoregram of the RT-PCR products of two H9N2 AIV from aquilsM:DNA標準DL-2 000;1:Qa/LC02/08的HA基因;2:Qa/LC01/11的HA基因;3:Qa/LC02/08的NA基因;4:Qa/LC01/11的NA基因M:DL-2 000 DNA Marker;1:HA(H9) gene fragment of Qa/LC02/08;2:HA(H9) gene fragment of Qa/LC01/11;3:NA(N2) gene fragment of Qa/LC02/08;4:NA(N2) gene fragment of Qa/LC01/11

    2.5HA和NA基因同源性分析HA基因長度為1 742 bp,NA基因長度為1 413 bp。2株鵪鶉分離株Qa/LC02/08與Qa/LC01/11的HA和NA基因的核苷酸同源性分別為97.7%和93.6%。

    分離毒株Qa/LC02/08HA基因核苷酸與A/Chicken/Shandong/JN/1999(H9N2)及A/Chicken/Zhejiang/ZC28/2007(H9N2)同源性最高,均為99.39%,而與A/Chicken/Shandong/N/2010(H9N2)、A/Chicken/Guangxi/G8/2009(H9N2)和鴨源A/Duck/Shanghai/C60/2007(H9N2)同源性分別為99.27%、99.08%和99.08%(表3)。NA基因核苷酸與A/Chicken/Shandong/N/2010(H9N2)、A/Chicken/Shandong/B2/2007(H9N2)和A/Chicken/Shandong/JL/2008(H9N2)的同源性分別為99.12%、98.46%和98.38%(表3)。表明鵪鶉分離株Qa/LC02/08確為H9N2亞型流感病毒。

    分離株Qa/LC01/11HA基因核苷酸與A/Chicken/Hebei/FL/2011(H9N2)、A/Chicken/Jiangsu/120/2011(H9N2)和A/Chicken/Shandong/H30/2011(H9N2)的同源性分別為99.63%、99.51%和99.45%(表3)。NA基因核苷酸與A/Chicken/Hebei/FL/2011(H9N2)、A/Chicken/Hebei/ZR/2010(H9N2)和A/Chicken/Shandong/WG18/2011(H9N2) 同源性均為99.7%,與A/Chicken/Jiangsu/SQ79/2011(H9N2)同源性為99.63%(表3)。表明鵪鶉分離株Qa/LC01/11確為H9N2亞型流感病毒。

    表3 2株鵪鶉H9N2流感病毒的HA和NA基因序列在線BLAST的主要結(jié)果Table 3 Main results of online BLAST of HA and NA gene sequences of two strains of quail H9N2 influenza virus

    3 討論

    近年來,鵪鶉流感病毒受到研究者的廣泛關(guān)注,特別是1997年香港禽流感感染者及家禽分離到的H5N1/97樣病毒,其內(nèi)部基因在進化關(guān)系上與鵪鶉來源的病毒株A/Quail/G1/97 (H9N2)高度同源[11]。1999年香港感染人的H9N2流感病毒HA基因與鵪鶉分離株A/Quail/G1/97 (H9N2)親緣關(guān)系相近,而其內(nèi)部基因與Hong Kong/97(H5N1)關(guān)系密切[12]。2007年之前,A/Quail/Gl /97株病毒是我國H9N2 AIV的主要流行亞系,持續(xù)在鵪鶉和其他陸禽間傳播[13]。張增峰等[9]對鵪鶉流感病毒SA受體分布特點的研究結(jié)果顯示,鵪鶉同時表達SAα-2,3半乳糖苷受體和SAα-2,6半乳糖苷受體,SAα-2,3半乳糖苷受體在氣管、支氣管呈弱陽性分布,副支氣管呈陽性分布,而SAα-2,6半乳糖苷受體在氣管、支氣管呈強陽性分布,表明鵪鶉呼吸道易與其他禽流感病毒和人流感病毒結(jié)合,并在其體內(nèi)發(fā)生流感病毒基因重配而形成新亞型病毒感染人的跡象,即鵪鶉也可充當產(chǎn)生人類流感大流行的中間宿主。因此,對鵪鶉流感病毒的監(jiān)測尤為重要。

    2006-2014年,我們自病死鵪鶉氣管中采集的23份樣品,經(jīng)接種雞胚分離后,通過HA試驗初步鑒定出19株流感病毒,其中2株H9陽性,17株H5陽性。事實上,我們試圖自鵪鶉不同器官中分離病毒,但未成功。2株H9陽性病毒HA與NA均通過RT-PCR擴增出特異目的條帶,進一步確定為H9N2流感病毒。

    同源性分析表明,Qa/LC02/08HA基因與山東1999年雞源H9N2毒株及浙江2007年雞源H9N2毒株同源性最高,達到99.39%,與2007-2009年浙江、上海、廣西、四川、江西、山東、湖北等地的雞源H9N2HA基因同源性均達到98.7%之上,其NA基因除與山東2010年雞源H9N2 AIV同源性達99%以上外,與2007-2009年山東、河南、江蘇、浙江、福建等地的雞源H9N2HA基因同源性均達到98%之上,表明H9N2 AIV跨地區(qū)傳播迅速,并且可在雞和鵪鶉間進行傳播。Qa/LC02/08HA基因與2007年上海鴨源分離株的同源性也達到了99.08%,其NA基因與2008年臺州豬源H9N2流感病毒的NA基因同源性達到97.87%,這也表明H9N2流感病毒有跨種傳播的能力,也間接地說明鵪鶉可以充當中間宿主的角色,既能感染禽源流感病毒又能感染哺乳動物源流感病毒,并將它們在其體內(nèi)發(fā)生重配,起到流感病毒混合器的作用,有可能引起哺乳動物及人類的流感大流行。

    Qa/LC01/11的HA基因與同年在河北、江蘇、山東、河南、山西等地雞源H9N2 AIV的同源性非常高,達到99.3%,其NA與2010-2013年河北、山東、天津、北京等地的雞源H9N2 AIVNA基因同源性達到98.67%之上,但其HA和NA基因均與河北本地的雞源分離株A/Chicken/Hebei/FL/2011(H9N2)的同源性最高,分別為99.6%和99.7%,進一步說明雞與鵪鶉可以相互傳播流感病毒,而且能夠在流行地區(qū)形成本地流行毒株在家禽中穩(wěn)定流行,因此,及時對家禽進行流感病毒監(jiān)測是防控禽流感的重要環(huán)節(jié)。另外,Qa/LC01/11的NA基因又與2008年豬源分離株A/Swine/Hebei/012/2008(H9N2)、雞源分離株A/Chicken/Hebei/7/2008(H9N2)及A/Chicken/Hebei/4/2008(H9N2)的同源性均為96.97%,同樣也說明鵪鶉可以同時感染禽源及哺乳動物源流感病毒,甚至引起基因重組而產(chǎn)生新的流感病毒。對鵪鶉流感病毒具有重要公共衛(wèi)生意義。

    此外,我們在雞胚傳代過程中發(fā)現(xiàn),用未經(jīng)稀釋的高滴度病毒尿囊液原液接種SPF雞胚所收獲的下一代雞胚尿囊液的HA滴度降低,這可能與病毒傳代過程中產(chǎn)生大量的缺陷型干擾(Defective interfering,DI)病毒有關(guān)。這與Von Magnus用未稀釋的流感病毒通過雞胚連續(xù)傳代時發(fā)現(xiàn)了不完整的或沒有感染力的DI病毒相一致[14]。在傳代過程中將上一代病毒尿囊液稀釋為4單位病毒再接種雞胚尿囊腔,收獲的下一代病毒尿囊液的HA滴度則明顯升高。故應(yīng)避免使用未加稀釋的高滴度病毒尿囊液接種雞胚,否則因產(chǎn)生大量DI病毒而導(dǎo)致流感病毒HA滴度大幅下降[1,14-15]。

    猜你喜歡
    尿囊傳代鵪鶉
    胎兒臍尿管未閉合并尿囊囊腫的產(chǎn)前超聲診斷及預(yù)后
    嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌遺傳性對其益生特性及貨架期菌數(shù)的影響
    鵪鶉與獵人
    塞尼卡病毒A在BHK-21細胞中培養(yǎng)條件探索
    我孵出鵪鶉寶寶啦
    微生物實驗室菌種復(fù)蘇傳代保存流程分析
    膀胱尿囊囊腫破裂合并臍膨出1例
    雞新城疫病毒抗原制備參數(shù)優(yōu)化相關(guān)性研究
    鵪鶉街的秘密
    鵪鶉迷宮
    成人国产av品久久久| 赤兔流量卡办理| 黑人欧美特级aaaaaa片| 青草久久国产| 国产又爽黄色视频| 我要看黄色一级片免费的| 中国三级夫妇交换| av.在线天堂| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产成人精品婷婷| 只有这里有精品99| 久久av网站| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产男女超爽视频在线观看| 久久这里有精品视频免费| 国产亚洲一区二区精品| 国产1区2区3区精品| 亚洲美女视频黄频| 永久免费av网站大全| 人妻一区二区av| 国产成人aa在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 一边亲一边摸免费视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲欧美色中文字幕在线| 性色avwww在线观看| 丰满乱子伦码专区| 日韩精品有码人妻一区| 在线观看免费日韩欧美大片| 免费大片黄手机在线观看| 丁香六月天网| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 人妻系列 视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产爽快片一区二区三区| 两性夫妻黄色片| 岛国毛片在线播放| 国产xxxxx性猛交| 蜜桃国产av成人99| 亚洲综合精品二区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 看免费成人av毛片| av线在线观看网站| 嫩草影院入口| 97在线视频观看| 欧美bdsm另类| 久久99一区二区三区| 亚洲精品美女久久av网站| 新久久久久国产一级毛片| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 亚洲欧洲日产国产| 国产极品天堂在线| 精品酒店卫生间| 高清在线视频一区二区三区| 日韩免费高清中文字幕av| 欧美精品国产亚洲| 日韩av不卡免费在线播放| 在线看a的网站| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲三级黄色毛片| 在线观看人妻少妇| 激情视频va一区二区三区| 久久久久久久久免费视频了| www.熟女人妻精品国产| 日韩av免费高清视频| 国产麻豆69| 制服诱惑二区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 最近中文字幕2019免费版| 在线天堂中文资源库| 99re6热这里在线精品视频| 国产精品不卡视频一区二区| 久久国产精品大桥未久av| 黑丝袜美女国产一区| 18禁国产床啪视频网站| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 飞空精品影院首页| 免费看av在线观看网站| 九色亚洲精品在线播放| 老司机亚洲免费影院| 亚洲国产欧美网| 日本爱情动作片www.在线观看| 9色porny在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 多毛熟女@视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲av福利一区| 亚洲美女黄色视频免费看| 伊人亚洲综合成人网| 满18在线观看网站| 老女人水多毛片| 欧美亚洲日本最大视频资源| 99九九在线精品视频| 少妇人妻久久综合中文| 免费观看av网站的网址| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 成人二区视频| 免费看av在线观看网站| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 在线观看免费视频网站a站| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 少妇熟女欧美另类| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 999精品在线视频| av女优亚洲男人天堂| 中文字幕精品免费在线观看视频| 午夜老司机福利剧场| av国产精品久久久久影院| 久久国产亚洲av麻豆专区| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲国产欧美网| 精品久久久精品久久久| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 99九九在线精品视频| 人妻人人澡人人爽人人| 日本欧美国产在线视频| 九色亚洲精品在线播放| 韩国高清视频一区二区三区| 韩国高清视频一区二区三区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久久国产欧美日韩av| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美 日韩 精品 国产| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产精品久久久久久精品电影小说| 在线 av 中文字幕| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 美女福利国产在线| 日韩成人av中文字幕在线观看| xxxhd国产人妻xxx| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久久久人妻精品一区果冻| 欧美少妇被猛烈插入视频| 99热网站在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲美女黄色视频免费看| 欧美日韩视频精品一区| 26uuu在线亚洲综合色| 久久久久精品久久久久真实原创| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲av成人精品一二三区| 免费在线观看黄色视频的| 超色免费av| 满18在线观看网站| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 中文字幕人妻丝袜制服| 免费观看av网站的网址| 中文字幕人妻丝袜制服| 人成视频在线观看免费观看| 在线看a的网站| 久久免费观看电影| 午夜日本视频在线| 永久免费av网站大全| 国产一区二区三区av在线| 精品国产乱码久久久久久小说| 一区二区av电影网| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 午夜福利视频精品| 国产精品一区二区在线不卡| 久久影院123| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲色图综合在线观看| av国产精品久久久久影院| 免费观看无遮挡的男女| 性色avwww在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲精品国产av成人精品| 在现免费观看毛片| 老司机影院成人| 少妇 在线观看| 飞空精品影院首页| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久狼人影院| 国产精品国产av在线观看| 国产av一区二区精品久久| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产精品不卡视频一区二区| 女性生殖器流出的白浆| 日本欧美视频一区| 久热这里只有精品99| 亚洲中文av在线| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产黄频视频在线观看| 国产成人91sexporn| 97在线视频观看| 国产av国产精品国产| 久久久久精品性色| 纯流量卡能插随身wifi吗| 一区二区日韩欧美中文字幕| 女人久久www免费人成看片| 国产有黄有色有爽视频| 久久久亚洲精品成人影院| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 午夜福利在线观看免费完整高清在| 男女边摸边吃奶| 十分钟在线观看高清视频www| 成人漫画全彩无遮挡| 日韩成人av中文字幕在线观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 99久国产av精品国产电影| 青春草国产在线视频| 男人舔女人的私密视频| 18+在线观看网站| 免费高清在线观看日韩| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 制服诱惑二区| 亚洲av男天堂| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲精品av麻豆狂野| 2021少妇久久久久久久久久久| 蜜桃国产av成人99| 日韩视频在线欧美| 捣出白浆h1v1| 久久99一区二区三区| 少妇被粗大猛烈的视频| 大片电影免费在线观看免费| 大片免费播放器 马上看| 国产精品免费视频内射| 自线自在国产av| 岛国毛片在线播放| 欧美人与善性xxx| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 欧美精品一区二区大全| 少妇人妻 视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 青青草视频在线视频观看| 嫩草影院入口| 激情视频va一区二区三区| 午夜影院在线不卡| 久久精品国产亚洲av涩爱| 天天操日日干夜夜撸| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲精品国产一区二区精华液| 青青草视频在线视频观看| 亚洲综合精品二区| 性色av一级| 欧美精品高潮呻吟av久久| 九草在线视频观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国精品久久久久久国模美| 日韩 亚洲 欧美在线| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产伦理片在线播放av一区| 黄频高清免费视频| 日本色播在线视频| 久久ye,这里只有精品| 久久韩国三级中文字幕| 下体分泌物呈黄色| 飞空精品影院首页| av在线app专区| 欧美激情 高清一区二区三区| 熟女电影av网| 少妇被粗大猛烈的视频| 在线观看国产h片| 国产精品久久久久成人av| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 日本欧美视频一区| 91精品三级在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 精品国产乱码久久久久久小说| 一级片'在线观看视频| 在线观看免费高清a一片| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产探花极品一区二区| 国产精品无大码| 日韩大片免费观看网站| 青春草亚洲视频在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 成人二区视频| 午夜福利乱码中文字幕| 大陆偷拍与自拍| 香蕉国产在线看| 中国国产av一级| 99久久精品国产国产毛片| 精品亚洲成a人片在线观看| 宅男免费午夜| 日韩av不卡免费在线播放| 日本vs欧美在线观看视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 狂野欧美激情性bbbbbb| 丝袜在线中文字幕| 国产精品国产av在线观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产成人91sexporn| 一级毛片电影观看| 久久影院123| 久久免费观看电影| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 90打野战视频偷拍视频| 成人免费观看视频高清| 母亲3免费完整高清在线观看 | 日韩av免费高清视频| 久久久久精品性色| 赤兔流量卡办理| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲熟女精品中文字幕| 在线观看国产h片| 99久国产av精品国产电影| 99久久人妻综合| 亚洲精品美女久久av网站| 男女下面插进去视频免费观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 韩国av在线不卡| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美bdsm另类| 国产精品三级大全| 精品少妇内射三级| 亚洲av综合色区一区| 久久这里有精品视频免费| 日本-黄色视频高清免费观看| 精品午夜福利在线看| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产日韩欧美亚洲二区| 女人久久www免费人成看片| 久久久国产精品麻豆| 最新的欧美精品一区二区| 男女边吃奶边做爰视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 人妻系列 视频| 亚洲男人天堂网一区| 只有这里有精品99| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 人妻系列 视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 永久免费av网站大全| 中文精品一卡2卡3卡4更新| av女优亚洲男人天堂| 精品人妻在线不人妻| 满18在线观看网站| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产成人免费无遮挡视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产男女超爽视频在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 中文字幕精品免费在线观看视频| 91成人精品电影| 欧美日韩综合久久久久久| 久久久久视频综合| 不卡av一区二区三区| 久久狼人影院| 男的添女的下面高潮视频| 一级毛片电影观看| 超碰97精品在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 青草久久国产| 天堂8中文在线网| 欧美亚洲日本最大视频资源| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲欧洲国产日韩| 午夜老司机福利剧场| 免费少妇av软件| 午夜日本视频在线| 国产人伦9x9x在线观看 | 最近中文字幕2019免费版| 国产成人91sexporn| 成年人午夜在线观看视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久久久国产精品人妻一区二区| kizo精华| 国产一区二区三区av在线| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 老司机影院成人| 欧美亚洲日本最大视频资源| 日本91视频免费播放| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产伦理片在线播放av一区| 日本-黄色视频高清免费观看| 日韩一本色道免费dvd| 久久精品国产亚洲av高清一级| 婷婷色综合大香蕉| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 曰老女人黄片| 在线观看免费视频网站a站| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲色图综合在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 最新的欧美精品一区二区| 国产精品免费大片| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产淫语在线视频| 在线天堂最新版资源| 黄片无遮挡物在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| av国产久精品久网站免费入址| 自线自在国产av| 欧美日韩综合久久久久久| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲成人一二三区av| 高清视频免费观看一区二区| 两性夫妻黄色片| 欧美精品av麻豆av| 丰满饥渴人妻一区二区三| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲综合色惰| 午夜老司机福利剧场| 久久狼人影院| 男人操女人黄网站| av国产久精品久网站免费入址| 国产淫语在线视频| 波多野结衣一区麻豆| av电影中文网址| 一区福利在线观看| 美女主播在线视频| 男男h啪啪无遮挡| 波多野结衣av一区二区av| 交换朋友夫妻互换小说| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产精品蜜桃在线观看| 欧美xxⅹ黑人| 在线观看国产h片| 自线自在国产av| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国精品久久久久久国模美| 日韩视频在线欧美| 91国产中文字幕| 亚洲国产精品一区三区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 捣出白浆h1v1| 久久久久视频综合| 妹子高潮喷水视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 香蕉丝袜av| 少妇的丰满在线观看| 一区二区三区乱码不卡18| 1024香蕉在线观看| 日日撸夜夜添| 国产亚洲一区二区精品| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 一级毛片电影观看| 老熟女久久久| 麻豆av在线久日| 亚洲国产欧美网| 国产成人午夜福利电影在线观看| 99香蕉大伊视频| 一二三四在线观看免费中文在| 色网站视频免费| 丝袜人妻中文字幕| 精品卡一卡二卡四卡免费| 人妻 亚洲 视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 九色亚洲精品在线播放| 大香蕉久久网| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲,欧美精品.| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产精品免费视频内射| 国产探花极品一区二区| 精品午夜福利在线看| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲一码二码三码区别大吗| 青青草视频在线视频观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产极品天堂在线| 国产在视频线精品| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 少妇人妻久久综合中文| 欧美成人午夜精品| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 中文字幕最新亚洲高清| 黄色 视频免费看| 制服丝袜香蕉在线| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 欧美日韩一级在线毛片| 人妻少妇偷人精品九色| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产野战对白在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 午夜福利影视在线免费观看| 尾随美女入室| 亚洲av福利一区| 久久久久久久国产电影| a级毛片在线看网站| 久久精品国产综合久久久| 捣出白浆h1v1| 亚洲情色 制服丝袜| 国产成人精品一,二区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲欧美一区二区三区国产| 90打野战视频偷拍视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲av电影在线进入| 色视频在线一区二区三区| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产成人精品在线电影| 综合色丁香网| 秋霞伦理黄片| 在线观看三级黄色| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲精品,欧美精品| 欧美日韩av久久| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 中文字幕制服av| 街头女战士在线观看网站| 久久精品久久久久久久性| 青草久久国产| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 日本av免费视频播放| 老司机影院成人| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲内射少妇av| 亚洲少妇的诱惑av| 最黄视频免费看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲国产最新在线播放| 成年人免费黄色播放视频| 国产人伦9x9x在线观看 | 精品国产一区二区久久| 飞空精品影院首页| 免费人妻精品一区二区三区视频| 丝袜脚勾引网站| 天天操日日干夜夜撸| 日本欧美国产在线视频| 国产免费现黄频在线看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美日本中文国产一区发布| 一级毛片电影观看| 亚洲国产看品久久| xxx大片免费视频| 涩涩av久久男人的天堂| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 丝袜在线中文字幕| 久久99精品国语久久久| 热99国产精品久久久久久7| 欧美日韩综合久久久久久| 91精品伊人久久大香线蕉| 岛国毛片在线播放| 在线观看免费高清a一片| 久久鲁丝午夜福利片| 日本av手机在线免费观看| 91精品三级在线观看| 国产综合精华液| 一个人免费看片子| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲国产色片| av网站免费在线观看视频| 欧美日韩精品网址| 久久99一区二区三区| 亚洲精品日本国产第一区| 香蕉丝袜av| 亚洲国产欧美网| 叶爱在线成人免费视频播放| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 黄频高清免费视频| av不卡在线播放| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品久久久久成人av| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲综合精品二区| 制服丝袜香蕉在线| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲av日韩在线播放| 色婷婷久久久亚洲欧美| 精品福利永久在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 国产成人aa在线观看| 一区二区三区精品91| 久久久久精品性色| 1024视频免费在线观看| 国产日韩欧美视频二区| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美亚洲日本最大视频资源| 中文字幕人妻熟女乱码| 丝瓜视频免费看黄片| 美女国产视频在线观看| 亚洲伊人色综图| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲中文av在线| 丝袜美足系列| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 2022亚洲国产成人精品| 国产一级毛片在线| 99香蕉大伊视频| 新久久久久国产一级毛片| 日韩中文字幕视频在线看片| 成年动漫av网址|