時差成像系統(tǒng)對囊胚培養(yǎng)及妊娠結(jié)局的影響

高洋，劉軍霞，朱家紅，韓偉，黃國寧

(重慶市婦幼保健院遺傳與生殖研究所，重慶 400013)

隨著人類輔助生殖技術(shù)(ART)不斷發(fā)展，囊胚培養(yǎng)的應(yīng)用更加廣泛。移植囊胚階段的胚胎與卵裂期胚胎相比，可以提高胚胎與子宮內(nèi)膜容受的同步性，增加對胚胎的體外篩選并獲得更好的妊娠率和著床率[1-4]。但囊胚培養(yǎng)延長了胚胎在體外的培養(yǎng)和暴露時間，因此，對實驗室的體外培養(yǎng)體系有更高要求，優(yōu)良的體外培養(yǎng)條件是促進(jìn)囊胚形成的重要因素之一[5-6]。

時差成像系統(tǒng)(time-lapse imaging，TLI)是近年來發(fā)展的一種新的無創(chuàng)胚胎培養(yǎng)與評估體系，能實時觀察從胚胎受精開始到其移植的連續(xù)動態(tài)分裂圖像。并且與傳統(tǒng)培養(yǎng)體系相比，TLI能夠避免胚胎被多次移出培養(yǎng)箱觀察，為胚胎發(fā)育提供了更穩(wěn)定的溫度、濕度、PH值及氣體含量等培養(yǎng)條件。研究表明TLI能為胚胎培養(yǎng)提供安全穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，更好地預(yù)測胚胎的發(fā)育潛能并改善卵裂期胚胎的妊娠結(jié)局[7-10]。TLI的這些優(yōu)勢為囊胚培養(yǎng)提供了新的思路，本研究通過比較TLI與常規(guī)培養(yǎng)系統(tǒng)的囊胚培養(yǎng)效果及囊胚移植后的妊娠結(jié)局，旨在提高囊胚形成率、優(yōu)化囊胚培養(yǎng)方案。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2017年1月至2018年12月在本中心接受ART治療并行囊胚培養(yǎng)的不孕患者的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：女方年齡<40歲；單純輸卵管因素不育；第1次行囊胚培養(yǎng)并在獲得可利用囊胚后行全囊胚冷凍，待內(nèi)膜準(zhǔn)備后移植凍融囊胚的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除子宮及宮腔病變、男方精液異常、夫妻雙方患染色體疾病的患者。所有患者均自愿進(jìn)行囊胚培養(yǎng)并簽署了囊胚培養(yǎng)知情同意書。

本研究共納入481例不孕患者(481個周期)，根據(jù)囊胚培養(yǎng)方式不同分為采用TLI系統(tǒng)進(jìn)行囊胚培養(yǎng)的TLI組(n=189)和采用傳統(tǒng)培養(yǎng)體系培養(yǎng)囊胚的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)系統(tǒng)(SI)組(n=292)。

二、研究方法

1.促排卵、取卵、受精：所有患者均采用我中心的標(biāo)準(zhǔn)長方案[11]進(jìn)行促排卵，當(dāng)至少3個主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)到18 mm時，于當(dāng)晚注射HCG(Ovidrel，Merck Serono，意大利)5 000～10 000 U，36～38 h后在陰道超聲引導(dǎo)下行穿刺取卵。獲得的卵冠丘復(fù)合物在2.5 ml G-IVF培養(yǎng)液(Vitrolife Sweden AB，瑞典)中培養(yǎng)至受精。對所有患者行常規(guī)IVF，即HCG注射后39～40 h將卵母細(xì)胞加入約含10 000～15 000條精子的精子滴內(nèi)共同培養(yǎng)，18 h后去除卵母細(xì)胞外顆粒細(xì)胞，顯微鏡下觀察出現(xiàn)兩個原核視為正常受精。

2.囊胚培養(yǎng)及評分：(1)TLI培養(yǎng)系統(tǒng)：將正常受精的合子轉(zhuǎn)入含G-1培養(yǎng)液(Vitrolife Sweden AB，瑞典)的TLI專用培養(yǎng)皿(EmbryoSlideTM，Unisense Fetilitech，丹麥)中，放置于TLI(EmbryoScopeTM，Unisense Fertilitech，丹麥)培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)至受精后66～68 h(D3)，暫停圖像，取出培養(yǎng)皿，將G-1培養(yǎng)液吸盡換成囊胚G-2培養(yǎng)液(Vitrolife Sweden AB，瑞典)，再次放入TLI系統(tǒng)中培養(yǎng)至113～139 h(D5～D6)。TLI系統(tǒng)每5 min記錄1次胚胎圖像并生成動態(tài)胚胎發(fā)育視頻，根據(jù)視頻圖像結(jié)合Peter卵裂期胚胎評分系統(tǒng)[12]和Gardner囊胚評分系統(tǒng)[13]進(jìn)行胚胎評分和選擇。將D3發(fā)育至4～10個卵裂球，評級為Ⅰ～Ⅲ級的胚胎定義為可利用胚胎，評級標(biāo)準(zhǔn)如下：Ⅰ級：卵裂球大小均勻、形狀規(guī)則、胞質(zhì)均勻、無顆?，F(xiàn)象、碎片<10%；Ⅱ級：卵裂球大小稍不均勻、形狀稍不規(guī)則、胞質(zhì)有少量顆粒、碎片10%～20%；Ⅲ級：卵裂球不均勻、形狀不規(guī)則、胞質(zhì)有明顯顆粒現(xiàn)象、碎片20%～50%；Ⅳ級：卵裂球嚴(yán)重不均勻、形狀嚴(yán)重不規(guī)則、胞質(zhì)有嚴(yán)重顆粒、碎片>50%。囊胚評級根據(jù)囊腔擴(kuò)張程度分為1期(囊胚腔小于囊胚體積的50%)、2期(囊胚腔超過囊胚體積的50%)、3期(囊胚腔充滿整個囊胚)、4期(囊胚擴(kuò)張、體積變大并透明帶變薄)、5期(囊胚部分從透明帶孵出)和6期(囊胚完全孵出)。對3～6期的囊胚再根據(jù)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行評級：內(nèi)細(xì)胞團(tuán)A級為細(xì)胞數(shù)量多且分布緊密，B級為細(xì)胞數(shù)量較少且松散，C級為細(xì)胞數(shù)量極少；滋養(yǎng)層A級為細(xì)胞較多且連接緊密，B級為細(xì)胞少且連接松散，C級為細(xì)胞極少。(2)SI培養(yǎng)系統(tǒng)：將正常受精的合子轉(zhuǎn)入含G-1培養(yǎng)液的Nunclon細(xì)胞培養(yǎng)皿(NunclonTM，Nunc，丹麥)中，放置于常規(guī)培養(yǎng)箱(SANYO，MCO-5M，日本)中進(jìn)行培養(yǎng)，并于受精后44～46 h(D2)、66～68 h(D3)分別取出，在顯微鏡下觀察并記錄胚胎評分情況，將D3可利用胚胎(4細(xì)胞Ⅲ級以上胚胎)轉(zhuǎn)入囊胚G-2培養(yǎng)液中，再次放入常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至受精后113～115 h(D5)及137～139 h(D6)觀察囊胚形成情況。參照Gardner囊胚評分標(biāo)準(zhǔn)，將D5或D6評級高于3CC的囊胚定義為可利用囊胚。囊胚擴(kuò)張程度達(dá)到或高于3期(即3、4、5、6期)，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞達(dá)到BB級及以上(包括AA、AB、BA、BB)的囊胚視為優(yōu)質(zhì)囊胚。

3.囊胚冷凍、復(fù)蘇與移植：對所有可利用囊胚行激光打孔人工皺縮后，采用商品化冷凍與復(fù)蘇液(Kita，Toyota，日本)按照試劑盒提供方法進(jìn)行囊胚冷凍與復(fù)蘇?；颊咴谀遗呃鋬?個月經(jīng)周期后采用人工周期的方法準(zhǔn)備內(nèi)膜，當(dāng)內(nèi)膜厚度達(dá)到7 mm以上時加用孕激素(Crinone，Merck Serono，丹麥)轉(zhuǎn)化子宮內(nèi)膜，并于第5天選擇復(fù)蘇囊胚1～2枚。兩組患者均按D5優(yōu)質(zhì)囊胚、D6優(yōu)質(zhì)囊胚、D5可利用囊胚、D6可利用囊胚的順序選擇復(fù)蘇囊胚。TLI組在此順序基礎(chǔ)上再結(jié)合動態(tài)圖像優(yōu)先選擇復(fù)蘇細(xì)胞期階段不存在直接卵裂模式的優(yōu)質(zhì)或可利用囊胚，即D5優(yōu)質(zhì)囊胚如出現(xiàn)直接卵裂則選擇復(fù)蘇D6優(yōu)質(zhì)囊胚，依此類推。直接卵裂模式包括1細(xì)胞直接卵裂至3細(xì)胞(1至3細(xì)胞卵裂)和2細(xì)胞直接卵裂至5細(xì)胞(2至5細(xì)胞卵裂)(圖1)。復(fù)蘇囊胚轉(zhuǎn)入G-2培養(yǎng)液中培養(yǎng)2～4 h等待移植，移植前觀察囊胚完全擴(kuò)張或未擴(kuò)張但50%以上細(xì)胞存活即可在腹部B超引導(dǎo)下行囊胚移植。

A：1細(xì)胞直接卵裂至3細(xì)胞；B：2細(xì)胞直接卵裂至5細(xì)胞圖1 直接卵裂模式示意圖

4.觀察指標(biāo)：主要觀察指標(biāo)為囊胚形成率、可利用囊胚率、優(yōu)質(zhì)囊胚率、臨床妊娠率、著床率和流產(chǎn)率。囊胚形成率=囊胚形成數(shù)/培養(yǎng)囊胚數(shù)×100%；可利用囊胚率=可利用囊胚數(shù)/培養(yǎng)囊胚數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)囊胚率=優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)/培養(yǎng)囊胚數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠患者數(shù)/移植周期數(shù)×100%；著床率=孕囊數(shù)/總移植胚胎數(shù)×100%；流產(chǎn)率=早期自然流產(chǎn)患者數(shù)/臨床妊娠患者數(shù)×100%。臨床妊娠率和著床率是以胚胎移植后5周通過超聲檢查探及宮內(nèi)孕囊為標(biāo)準(zhǔn)。早期自然流產(chǎn)是指臨床妊娠12周之前的妊娠丟失。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組患者的一般資料比較

兩組患者的年齡、體重指數(shù)(BMI)、抗苗勒管激素(AMH)水平、不孕年限、Gn總量、獲卵數(shù)及轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者的一般資料比較(-±s)

二、兩組患者的囊胚培養(yǎng)結(jié)局比較

兩組患者的受精率、2PN卵裂率和D3可利用胚胎率、囊胚形成率、可利用囊胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者囊胚培養(yǎng)結(jié)局比較(%)

三、TLI組胚胎直接卵裂結(jié)果

TLI組形成的可利用囊胚中有39枚來源于1細(xì)胞直接卵裂為3細(xì)胞的胚胎，有20枚來源于2細(xì)胞直接卵裂至5細(xì)胞的胚胎，分別占可利用囊胚的比率為4.11%(39/949)和2.11%(20/949)。共有3例患者移植的囊胚中含有直接卵裂來源的胚胎：其中1例患者僅獲1枚可利用囊胚并來源于1細(xì)胞直接卵裂為3細(xì)胞的胚胎，移植后未妊娠；另2例患者均獲2枚囊胚，其移植的2枚囊胚中分別含有1枚1細(xì)胞直接卵裂為3細(xì)胞的胚胎和1枚2細(xì)胞直接卵裂為5細(xì)胞的胚胎，均獲得1個著床孕囊。

四、兩組患者移植囊胚質(zhì)量比較

截至2019年12月31日，共有360例患者入院接受復(fù)蘇囊胚移植，其中TLI組143例，SI組217例。兩組間移植囊胚數(shù)、移植優(yōu)質(zhì)囊胚率、移植D5及D6囊胚率比較均無顯著性差異(P>0.05)；兩組中移植D5囊胚率均顯著高于同組移植D6囊胚率(P<0.05)(表3)。

表3 兩組患者移植囊胚質(zhì)量比較[(-±s)，%]

五、兩組患者臨床結(jié)局比較

TLI組移植后的臨床妊娠率和著床率均顯著高于SI組(P<0.05)；兩組患者的流產(chǎn)率比較無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 兩組患者妊娠結(jié)局比較(%)

討 論

TLI作為新的胚胎培養(yǎng)與評分系統(tǒng)，因其穩(wěn)定可控，并能夠提供胚胎動力學(xué)參數(shù)的優(yōu)勢明顯，已越來越廣泛地應(yīng)用在卵裂期胚胎的培養(yǎng)與選擇中。目前已有較多文獻(xiàn)報道采用TLI進(jìn)行卵裂期胚胎培養(yǎng)的效果及妊娠結(jié)局優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)箱[9，14-16]，也有研究表明TLI得出的卵裂期胚胎動力學(xué)參數(shù)能夠預(yù)測囊胚的形成率及囊胚質(zhì)量[17-18]，而TLI直接應(yīng)用于囊胚培養(yǎng)效果的評價甚少。本研究比較了采用TLI與SI行囊胚培養(yǎng)的效果，結(jié)果顯示兩者的囊胚形成效果相似，但移植TLI培養(yǎng)形成囊胚的臨床妊娠率和著床率均顯著高于傳統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)。Pribenszky等[14]通過meta分析，提出移植TLI系統(tǒng)培養(yǎng)的胚胎能夠獲得更高的臨床妊娠率和更低的流產(chǎn)率。Alhelou等[10]研究發(fā)現(xiàn)與TLI培養(yǎng)系統(tǒng)相比，普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的胚胎早期發(fā)育未受影響，但從D3開始的后期發(fā)育受不穩(wěn)定培養(yǎng)條件的影響逐漸顯現(xiàn)，結(jié)果顯示TLI中培養(yǎng)的囊胚移植后著床率更高。

TLI可以避免胚胎被移出觀察時多次開關(guān)培養(yǎng)箱造成的培養(yǎng)環(huán)境改變，能為胚胎發(fā)育提供更穩(wěn)定的外環(huán)境，為卵裂期胚胎的培養(yǎng)提供了更好的選擇。但因為本研究中將胚胎培養(yǎng)至囊胚期采用的是序貫培養(yǎng)基，因此需在第3日將胚胎移出換液，無法使囊胚在整個過程中培養(yǎng)環(huán)境保持恒定。另一方面TLI的安全性亦存在爭議，為了獲得連續(xù)的胚胎發(fā)育圖像，TLI中圖像采集系統(tǒng)會定時對胚胎進(jìn)行拍照，這種周期性光源照射可能會對胚胎發(fā)育產(chǎn)生危害[19]。但是已有研究報道采用TLI培養(yǎng)并移植的胚胎能夠獲得健康活產(chǎn)嬰兒[15，20]，提示TLI可能并不影響胚胎發(fā)育，但其觀察系統(tǒng)的安全性仍有待進(jìn)一步評估。這些影響因素可能是本研究結(jié)果中TLI組囊胚形成率、可利用囊胚率及優(yōu)質(zhì)囊胚率未顯著高于SI組的原因。

本研究中兩組患者均根據(jù)Gardner囊胚評分系統(tǒng)對囊胚進(jìn)行形態(tài)學(xué)上的評分和選擇，TLI組中由于提供了胚胎動態(tài)發(fā)育圖像，使我們能夠獲得更多參考指標(biāo)，包括各種時間參數(shù)和卵裂模式。目前國內(nèi)外針對這些動態(tài)參數(shù)運(yùn)用于胚胎選擇的研究甚多，但哪些指標(biāo)效果最佳仍無定論。近期，胚胎異常卵裂模式中的直接卵裂受到了很多關(guān)注。一些研究表明，由直接卵裂發(fā)育而來的胚胎發(fā)育潛能低下、種植率和出生率降低、流產(chǎn)率增高，但此種類型的胚胎可能在形態(tài)學(xué)上并未表現(xiàn)出明顯異常，亦可發(fā)育成為可利用囊胚，因此通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方式的胚胎觀察無法進(jìn)行識別和篩選[21-23]。本研究中為了提高工作效率、優(yōu)化胚胎選擇流程，TLI組在胚胎選擇時采用形態(tài)學(xué)評分結(jié)合細(xì)胞期階段無直接卵裂模式的參考指標(biāo)篩選囊胚。有文獻(xiàn)報道胚胎卵裂模式異常的原因可能是多倍體和遺傳紊亂，采用TLI動態(tài)指標(biāo)聯(lián)合形態(tài)學(xué)評估篩選胚胎可以降低非整倍體風(fēng)險，繼而提高胚胎著床潛能[24-25]。目前，胚胎發(fā)生直接卵裂的原因尚不清楚，有研究分析認(rèn)為異常增多的中心?？赡芤鸺忓N體形成三極結(jié)構(gòu)，造成卵裂球在有絲分裂過程中染色質(zhì)異常分離而直接分裂成3細(xì)胞[22-23，25]。另外，直接卵裂細(xì)胞也可能存在染色體整合不完全、微核形成或多核的核缺陷[22]。本研究中TLI組在囊胚移植時采用形態(tài)學(xué)評分結(jié)合動態(tài)發(fā)育指標(biāo)的方法選擇胚胎，結(jié)果獲得了明顯升高的妊娠率和著床率，這與Meseguer等[9]和Rubio等[26]研究報道的結(jié)果一致。

囊胚培養(yǎng)可以有效剔除卵裂期至囊胚期發(fā)育過程中潛能差或部分染色體異常的胚胎，并且囊胚期胚胎移植與子宮內(nèi)膜同步性更佳，因此囊胚移植的妊娠結(jié)局更好，但囊胚著床的影響因素仍較多。為了降低研究偏倚，本研究均納入凍融囊胚移植的患者，且通過人工周期準(zhǔn)備內(nèi)膜減少了鮮胚周期卵巢刺激、血清激素水平[27]及內(nèi)膜因素等的干擾。

綜上所述，目前并無確切證據(jù)表明采用TLI行囊胚培養(yǎng)的效果優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)，本研究中由于采用了序貫培養(yǎng)基而影響了TLI系統(tǒng)中囊胚發(fā)育環(huán)境的穩(wěn)定性，今后可以嘗試換用一步法的單一培養(yǎng)基進(jìn)行操作，以進(jìn)一步證實TLI是否有利于囊胚的形成。本研究結(jié)果中TLI培養(yǎng)的囊胚移植妊娠結(jié)局更佳，可能與TLI系統(tǒng)聯(lián)合了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)與TLI動態(tài)指標(biāo)對囊胚進(jìn)行篩選有關(guān)。另一方面雖然TLI可以實時拍攝并存儲胚胎發(fā)育圖像，但由此產(chǎn)生的數(shù)據(jù)指標(biāo)很多，且大部分軟件需要手動標(biāo)記、分析動態(tài)指標(biāo)，繁瑣的工作量限制了TLI動力學(xué)參數(shù)的廣泛運(yùn)用，采用TLI行囊胚培養(yǎng)聯(lián)合人工智能分析圖像選擇胚胎將是我們將來的研究方向。