卵母細胞玻璃化冷凍對臨床妊娠結局的影響

朱序理，曹金鳳，孫慶云，馮騰飛，韓嫣，杜元杰，郝桂敏

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，石家莊 050000)

隨著輔助生殖技術(ART)的發(fā)展，近幾年，卵母細胞冷凍一直是生殖領域的研究熱點。自1999年世界首例卵母細胞玻璃化冷凍嬰兒誕生以來[1]，隨著玻璃化冷凍技術的成熟以及卵胞漿內單精子注射(ICSI)的應用，卵母細胞的冷凍復蘇率、受精率和臨床妊娠率都有較大的提高，但玻璃化冷凍的卵母細胞和新鮮卵母細胞行ICSI后其受精、卵裂情況以及妊娠結局，尤其是活產情況、嬰兒出生缺陷等有否區(qū)別，尚沒有足夠的研究證據(jù)。本研究通過回顧性分析冷凍卵母細胞和新鮮卵母細胞行ICSI后的受精、卵裂情況及妊娠結局差異，旨在更好地評價卵母細胞冷凍技術在臨床應用中的可行性及有效性，以更好地指導臨床工作。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2012年1月至2018年12月在河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院生殖醫(yī)學中心利用冷凍卵母細胞進行ICSI-ET治療的37例患者(共37個周期)的臨床資料(觀察組)。入組標準：(1)在取卵日男方取精失敗或無法獲得足夠可受精的精子(包括因各種原因取卵日男方不能來院者)，同時拒絕供精治療的患者夫婦；(2)行全部卵母細胞或部分成熟卵母細胞玻璃化冷凍保存，且在此期間解凍移植。采用傾向性評分(PSM)匹配方法按照1∶5匹配(按冷凍MⅡ卵母細胞、年齡、不孕類型、移植日期，卡鉗值0.1)，從同期在本中心行新鮮卵母細胞ICSI的3 532個周期中篩選出179例患者(共181個周期)為對照組。所有患者納入標準：(1)促排卵方案均為長方案；(2)周期數(shù)≤2周期、獲卵數(shù)≥2枚；(3)患者移植卵裂期胚胎且移植胚胎數(shù)均為2枚。排除標準：合并輸卵管積水、子宮內膜異位癥、宮腔積液及子宮肌瘤等的患者。

二、研究方法

1.卵母細胞冷凍：取卵后培養(yǎng)2～4 h去除顆粒細胞冷凍MⅡ卵母細胞，采用封閉式載體冷凍，試劑從冰箱取出后平衡20～30 min，將2～3個卵母細胞放入含7.5%乙二醇(EG)和7.5%二甲基亞砜(DMSO)的平衡液中，室溫沖洗5遍以上。當卵母細胞出現(xiàn)皺縮再擴張(至少恢復達到80%以上，時間控制在6～8 min)時，移入含15%EG和15%DMSO的?；褐?，沖洗5遍以上，迅速用吸管將胚胎一次性放入冷凍載體上，封管并置入液氮，整個過程不超過70 s，將卵母細胞于液氮中保存。

2.卵母細胞復蘇：將含胚胎載體從液氮中取出，迅速置入37℃平衡好的復蘇液1(1.0 mol/L蔗糖溶液)中平衡1 min，體視鏡下可見胚胎滑落。然后順序轉移至復蘇液2(0.5 mol/L蔗糖溶液)室溫2 min，復蘇液3(0.25 mol/L蔗糖溶液)室溫3 min，含10%人血清白蛋白(HSA)取卵胚胎處理液(G-MOPS，Vitrolife，瑞典)的復蘇液4室溫5 min，并逐漸升溫至37℃。在培養(yǎng)液中清洗數(shù)遍，最后轉移至已平衡過夜的含5%HSA的受精培養(yǎng)液(G-IVF，Vitrolife，瑞典)中，6%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3 h后，對存活卵母細胞行ICSI。

3.卵母細胞存活標準：在顯微鏡下觀察，若卵母細胞外觀均勻透亮，無細胞質變性、卵細胞腫脹或固縮，無透明帶斷裂，則判斷為卵母細胞存活；若細胞質變性、固縮、變黑，或有透明帶斷裂現(xiàn)象，則判定為卵母細胞死亡。

4.不同患者內膜準備：自然周期移植：月經周期規(guī)律、排卵正常者采用此周期，在月經第9～10天開始監(jiān)測卵泡發(fā)育及子宮內膜情況，如內膜厚度≤7 mm給予戊酸雌二醇(補佳樂，拜耳，德國)2～4 mg口服，2次/d，卵泡消失日結合血E2水平解凍卵母細胞，行ICSI；同時給予黃體酮(浙江仙琚制藥)20 mg肌肉注射，1次/d，第3天優(yōu)選2枚胚胎移植。移植后行常規(guī)黃體支持[黃體酮20 mg肌肉注射1次/d，或黃體酮陰道緩釋凝膠(默克雪蘭諾，英國)90 mg陰道給藥1次/d]，B超見心管博動2周后逐漸減量至停止。

人工周期移植：月經第3天給予戊酸雌二醇2～4 mg，2次/d，可根據(jù)患者的內膜情況增加用藥劑量，待內膜厚度≥8 mm、血E2≥732 pmol/L時給予黃體酮40 mg、60 mg、60 mg、60 mg，每日肌肉注射，于肌肉注射黃體酮40 mg當天解凍卵母細胞行ICSI，第3天優(yōu)選2枚胚胎移植。移植后行黃體支持(黃體酮60 mg肌肉注射1次/d或黃體酮陰道緩釋凝膠90 mg陰道給藥1次/d)，B超見心管博動后逐漸減量至停止。

5.臨床妊娠判斷：胚胎移植后14 d檢測尿或血清β-HCG水平，尿HCG陽性或血β-HCG>10 U/L定義為HCG陽性；胚胎移植4～5周行B超檢查見妊娠囊及原始心管搏動者確定為臨床妊娠。

6.觀察指標：觀察兩組的卵母細胞存活率、受精率、卵裂率、可利用胚胎率、臨床妊娠率、種植率、流產率、宮外孕率、活產率及出生缺陷情況。卵母細胞存活率=存活卵母細胞數(shù)/解凍卵母細胞數(shù)×100%；正常受精率(2PN受精率)=2PN受精卵數(shù)/ICSI卵數(shù)×100%；2PN卵裂率=2PN卵裂數(shù)/2PN受精卵數(shù)×100%；可利用胚胎率=(移植胚胎數(shù)+冷凍胚胎數(shù))/2PN受精卵數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/新鮮移植周期數(shù)或解凍卵母細胞移植周期數(shù)×100%；種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎總數(shù)×100%；流產率=流產周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；宮外孕率=宮外孕周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；活產率=活產率周期數(shù)/胚胎移植的周期總數(shù)。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、兩組患者的一般資料比較

觀察組和對照組平均年齡分別為(28.6±4.0)歲和(28.9±3.7)歲，移植卵裂胚數(shù)均為2枚。兩組間子宮內膜厚度、MⅡ卵母細胞數(shù)、平均年齡、原發(fā)不孕比例比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者的一般資料比較[(-±s)，M(Q25，Q75)，%]

二、觀察組卵母細胞復活情況及兩組患者受精、胚胎發(fā)育情況比較

觀察組共37個周期進行卵母細胞冷凍并解凍后移植，共冷凍361枚卵母細胞，復蘇后存活卵母細胞344枚，復活率達95.3%(344/361)。

兩組患者的2PN受精率比較無顯著性差異(P>0.05)；觀察組的2PN卵裂率、可利用胚胎率顯著低于對照組(P<0.01)(表2)。

表2 兩組患者受精及胚胎發(fā)育情況比較(%)

三、兩組患者的妊娠結局比較

觀察組37個周期胚胎移植后，獲得20例妊娠，其中1例流產，活產19例，單胎12例，雙胎7例(包括1例雙胎自然減胎為單胎)，已分娩25例健康嬰兒，觀察組患者無出生缺陷兒。對照組181個周期胚胎移植后，獲得95例妊娠，單胎55例，雙胎40例(包括1例雙胎自然減胎為單胎，另1例雙胎分娩1例存活嬰兒和1例死嬰)，1例宮外孕，13例流產(單胎7例、雙胎6例)，活產81例，已分娩113例活嬰，出生隨訪有1例出生缺陷兒。統(tǒng)計結果顯示，兩組患者的臨床妊娠率、種植率、流產率、宮外孕率及活產率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 兩組患者的妊娠結局比較(n，%)

討 論

近10年來玻璃化冷凍卵母細胞技術逐漸成熟，2013年美國生殖醫(yī)學會提出卵母細胞冷凍保存不再屬于實驗研究技術，并將其列為成熟的臨床應用項目[2]。臨床上，生殖領域醫(yī)生一直比較關注玻璃化冷凍卵母細胞復蘇后ICSI的妊娠結局，與新鮮卵母細胞ICSI助孕的妊娠結局有無差別。本研究采用PSM匹配方法，去除年齡、內膜因素、MⅡ卵數(shù)、不孕類型、移植日期(年度差異)等因素對妊娠結局的影響；納入研究的兩組患者均采用長方案促排，周期數(shù)≤2周期，移植胚胎均為卵裂期胚胎，且移植胚數(shù)均為2枚；研究結果顯示兩組患者的臨床妊娠率、種植率、流產率、宮外孕率及活產率比較均無顯著性差異。提示冷凍卵母細胞能夠達到和新鮮卵母細胞相似的妊娠率及活產率，這和之前的文獻報道[3-5]相似。兩組患者活產率雖然沒有顯著性差異，但對照組患者活產率略低于觀察組，這可能與對照組受促排卵周期的影響，子宮內膜被高水平雌激素影響有關，故流產率稍高，活產率略低，但尚需后續(xù)加大樣本量進一步證實。本研究中觀察組患者獲得了較好的周期臨床妊娠率(54.1%)和活產率(51.4%)，進一步證實卵母細胞玻璃化冷凍確實是一種較好的生育力保存方法，可應用于取卵日男方因各種原因不能提供精子的女性患者[5-6]，如取卵日男方取精困難、取不到精子或特殊情況不能來院者，可將取出的卵母細胞冷凍保存。同時可應用于因卵巢功能早衰積攢卵母細胞的患者，以及行放療或化療等可能影響卵巢功能的患者，可在放療或化療前將患者的卵母細胞取出冷凍保存，保存其生育力。

本研究中玻璃化冷凍卵母細胞的復活率95.3%，高于Sole等[7]報道的卵母細胞復蘇率85.6%，也高于另兩位學者的報道[8-9]，和Cobo等[10]報道的復活率(96.7%)相似。玻璃化冷凍卵母細胞成功的關鍵是必須保證較高的卵母細胞存活率，這就要求在工作中應嚴格把握卵母細胞冷凍技術的關鍵環(huán)節(jié)，進一步改進冷凍載體及冷凍方法。卵母細胞玻璃化冷凍復活率相對于本生殖中心玻璃化冷凍胚胎復活率(99.41%)[11]較低，其原因在于卵母細胞是人體最大的細胞，胞膜和胞漿比例相對較小，卵膜滲透性差，細胞脫水不充分。因此，實驗室操作時應注意幾個關鍵步驟：在玻璃化冷凍卵母細胞時在平衡液中要充分平衡6 min或以上，即可見卵母細胞皺縮后擴張，一定在擴張達到80%以上，再移入下一步?；褐?，尤其卵母細胞質量差可適當延長在平衡液中的時間；而移入玻化液、裝載胚胎和投入液氮的總時間應控制在60～70 s；同時在解凍卵母細胞時要將液氮中含有卵母細胞的載體迅速置入37℃平衡好的復蘇液1(1.0 mol/L蔗糖)中，這是解凍的關鍵，其余復蘇液2、3、4為室溫下操作，當卵母細胞移入4號液后即逐漸升溫至37℃，以避免卵母細胞內冰晶再形成，從而造成卵母細胞損傷甚至崩解死亡。

本研究中觀察組和對照組的2PN受精率分別為85.8%和82.4%，二者比較無顯著性差異；而觀察組的2PN卵裂率及可利用胚胎率顯著低于對照組，該結果與之前文獻報道[12-13、4]略有不同，可能與玻璃化冷凍對卵母細胞有不利影響有關，成熟卵母細胞處于減數(shù)分裂中期，對溫度、理化因素非常敏感，冷凍過程可能存在卵母細胞的細胞骨架輕度損傷如皮質顆粒變化、線粒體丟失等[14]，雖然不影響卵母細胞受精和胚胎最終的發(fā)育結局，但部分影響了卵細胞的分裂，少部分胚胎存在細胞分裂速度慢等，繼而影響可移植胚胎數(shù)等。提示我們在臨床工作中能冷凍胚胎要優(yōu)先選擇冷凍胚胎，而不是優(yōu)先冷凍卵母細胞[15]；但玻璃化冷凍卵母細胞作為胚胎冷凍的補充，可以避免取卵日因取精不成功而造成女性生育資源的浪費和經濟損失，在生育力保存方面起著不可替代的作用[16-17]。

卵母細胞玻璃化冷凍復蘇后妊娠分娩的子代安全情況也是生殖領域比較關注的一個方面。Levi-Setti等[18]對意大利冷凍卵母細胞助孕出生的2 152例嬰兒進行隨訪分析，結果顯示新生兒先天異常的發(fā)生率為0.9%，表明玻璃化冷凍卵母細胞并不增加嬰兒出生缺陷[19-20]。本研究中觀察組37個周期共出生嬰兒25例，隨訪均健康且無智力水平的差異，無出生缺陷嬰兒；對照組共出生113例嬰兒，1例21三體嵌合嬰兒。提示冷凍卵母細胞技術是較成熟的技術，并未增加嬰兒出生缺陷的風險。但由于本研究樣本量小，尚需后續(xù)增大樣本量進一步證實。至于卵母細胞冷凍是否會對子代健康產生遠期影響有待于以后多中心大樣本的前瞻性研究和長期跟蹤隨訪加以探討。

本研究中兩組患者均移植2枚第3天的卵裂期胚胎，多胎率較高。為了預防雙胎引起早產，保障母嬰安全，今后的工作中應盡量采取第3天單胚胎移植或囊胚培養(yǎng)后行單囊胚移植，以降低多胎率。

綜上所述，玻璃化冷凍卵母細胞可獲得較高的復蘇率，且復蘇后行ICSI能達到和新鮮卵母細胞ICSI相似的受精率和妊娠結局，雖然其卵裂率和可利用胚胎率略有下降，但并不影響最終的妊娠結局；且并不增加嬰兒出生缺陷發(fā)生風險。因此，對于取卵日男方因各種原因不能提供精液的女性患者，卵母細胞玻璃化冷凍是一個較好的生育力保存方法。