口源性口臭相關(guān)微生物及揮發(fā)性含硫化合物的產(chǎn)生機(jī)制

單 晨,葉 瑋

口臭是指呼吸時口腔發(fā)出的不良?xì)馕?，是影響人們進(jìn)行社會交往和造成心理障礙的原因之一。在一些國家和地區(qū)，口臭已經(jīng)成為齲病和牙周病后，口腔科患者就診的第三大原因[1]。導(dǎo)致口臭的氣體主要有揮發(fā)性含硫化合物(volatile sulfur compounds, VSCs)，如硫化氫、甲基硫醇和二甲基硫醚，此外還有揮發(fā)性芳香烴復(fù)合物，如吲哚、甲基吲哚，有機(jī)酸如乙酸、丙酸，胺類如尸胺、腐胺等有機(jī)物也可引起口臭[2]。其中90%的口臭為口源性口臭，其病因有深齲、牙周病、口腔感染、種植體周圍炎、冠周炎、黏膜潰瘍、潴留的食物或殘渣、舌苔等[3]。研究發(fā)現(xiàn)，口腔內(nèi)的多種細(xì)菌與口臭的產(chǎn)生緊密相關(guān)[4]，了解口臭相關(guān)微生物及其產(chǎn)生揮發(fā)性硫化物的機(jī)制將有助于口臭的臨床治療。

鑒于此，本文就口源性口臭相關(guān)微生物及VSC產(chǎn)生機(jī)制作一綜述，以期厘清其發(fā)病機(jī)制，為口臭的病因?qū)W診斷及治療提供新的思路。

1 口源性口臭相關(guān)微生物

致臭氣體主要由口腔內(nèi)寄居的產(chǎn)臭細(xì)菌分解含硫食物殘渣、唾液、血液和上皮細(xì)胞產(chǎn)生[5]。口腔獨(dú)特的解剖結(jié)構(gòu)、局部適宜的溫度和充足的營養(yǎng)對口源性口臭相關(guān)的細(xì)菌繁殖和生長非常重要[6]。唾液是微生物的貯存庫，經(jīng)檢測，口腔中1 mL唾液的含菌量可達(dá)1×108個，它們主要來源于齦溝、牙周袋、舌背和其他黏膜表面的菌斑生物膜，并以懸浮的形式播散[7]。舌苔主要由脫落的上皮細(xì)胞、來自牙周袋的白細(xì)胞、血液代謝產(chǎn)物、食物殘渣和細(xì)菌構(gòu)成。舌背表面的舌乳頭形態(tài)結(jié)構(gòu)，尤其是舌乳頭的深度影響舌生物膜的構(gòu)成。舌背黏膜相對其他部位的口腔黏膜能容納更多的細(xì)菌，舌背單個脫落的上皮細(xì)胞能容納超過100個細(xì)菌，而其他口腔黏膜表面的單個脫落上皮細(xì)胞僅能容納25個細(xì)菌[8]。齦溝內(nèi)滲出的齦溝液為產(chǎn)臭菌提供豐富的底物，齦溝也是菌斑附著的主要部位。特別對于牙周炎患者，深而出血的牙周袋為產(chǎn)臭細(xì)菌提供了良好的生長繁殖環(huán)境。

目前認(rèn)為，口源性口臭源于口腔微生態(tài)的平衡被打破，口腔內(nèi)菌群失調(diào)造成產(chǎn)臭厭氧菌比例的增加，致臭菌含硫蛋白代謝產(chǎn)物釋放增多，從而引起口臭[9]。隨著微生物培養(yǎng)依賴性菌種檢測技術(shù)和以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的非培養(yǎng)依賴性菌種檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，近年來有多篇關(guān)于口源性口臭相關(guān)微生物的研究面世。

1.1 牙周致病菌

牙周病患者通常同時有口臭的困擾，多篇臨床研究探究口臭與牙周病發(fā)展之間的關(guān)系。有假說稱VSC可以加速牙周組織的破壞，而牙周袋的形態(tài)也為產(chǎn)硫細(xì)菌提供了理想的環(huán)境[10]。早在1990年，Persson等[11]證實了牙周致病菌如齒垢密螺旋體、牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌、福賽類桿菌和具核梭桿菌能從唾液蛋白中的半胱氨酸和甲硫氨酸中產(chǎn)生硫化氫和甲基硫醇。這之后，Mineoka等[12]研究也表明唾液中的牙齦卟啉單胞菌、齒垢密螺旋體、福賽坦氏菌的量與牙周健康及口腔氣體中的VSC水平相關(guān)聯(lián)，經(jīng)治療，隨著上述細(xì)菌的減少，牙周健康情況得到改善，同時口腔氣體中的VSC降低。Stephen等[13]研究發(fā)現(xiàn)與慢性牙周炎相關(guān)的口臭可能是由于舌生態(tài)的改變，而這改變受到牙周菌群微環(huán)境改變的影響。Apatzidou等[14]研究證實了人群中口臭與牙周病的關(guān)聯(lián)性，口臭在牙齦炎和牙周炎的病人中高發(fā)。Takeuchi等[15]也為探究牙周炎患者的口臭與牙周致病菌水平的關(guān)聯(lián)性作了相關(guān)研究，結(jié)果顯示唾液中的齒垢密螺旋體和福賽坦氏菌水平與口臭相關(guān)聯(lián)，唾液中的牙齦卟啉單胞菌比例與牙周炎相關(guān)聯(lián)。有足夠證據(jù)[16]提示牙周病會增加口臭的嚴(yán)重程度，牙周炎通過VSC產(chǎn)生部位的增加(牙縫間和齦下區(qū)域)、含硫底物的增加(脫落的上皮細(xì)胞和白細(xì)胞)以及甲硫氨酸的增加使口臭程度惡化。

1.2 Solobacterium moorei (S.moorei)

S.moorei是一種革蘭陽性的厭氧菌，近來被認(rèn)為是與口臭相關(guān)聯(lián)的特異性細(xì)菌[17]。S.moorei在多篇研究中被證實廣泛存在于口臭組樣本中，而在健康對照組中較少被檢測出。Haraszthy等對21例口臭患者和36例健康對照組舌后部樣本中的S.moorei進(jìn)行分離純化，16S rDNA測序，結(jié)果顯示口臭組樣本中S.moorei的檢出率為100%，而對照組中的檢出率僅為14%，并且發(fā)現(xiàn)S.moorei的存在與口臭的感官指標(biāo)相關(guān)性最高，與VSC的水平、舌苔指數(shù)也有很大的相關(guān)性，此外所有S.moorei菌株都可以在嚴(yán)格厭氧瓊脂和OOPS介質(zhì)培養(yǎng)中產(chǎn)生硫化氫[17]。Riggio等[18]運(yùn)用相同測序方法也發(fā)現(xiàn)S.moorei僅在口臭組舌苔樣本中被檢測出。Ren等[19]運(yùn)用細(xì)菌16S rRNA基因測序和宏基因測序方法比較有口臭的兒童和健康兒童舌苔細(xì)菌群落的差異，顯示S.moorei在口臭樣本中的含量高于對照組。Tanabe等[17]通過體外試驗證實了S.moorei通過產(chǎn)生VSC致臭。

1.3 唾液鏈球菌

唾液鏈球菌屬于口腔正常菌群，可參與宿主局部生物屏障的構(gòu)成，維持宿主口腔菌群的生態(tài)平衡。研究顯示，與健康者相比，口臭者口腔中唾液鏈球菌數(shù)量較少。Riggio等[18]運(yùn)用16S rRNA基因測序，結(jié)果亦表明唾液鏈球菌是健康對照組舌背上的優(yōu)勢菌。研究表明，唾液鏈球菌至少可以產(chǎn)生兩種羊毛硫樣細(xì)菌素：唾液素A和唾液素B。對其他菌株(通常為近緣菌株)而言，唾液素A和唾液素B是致死的物質(zhì)，其化學(xué)基質(zhì)是蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的糖或脂的復(fù)合物。不同細(xì)菌素作用方式不同，比如可抑制蛋白質(zhì)合成或影響細(xì)胞的DNA。唾液素A是抑菌劑，唾液素B是殺菌劑，它們皆可以對產(chǎn)VSC菌進(jìn)行抑制作用。

1.4 念珠菌

念珠菌為單細(xì)胞酵母樣真菌，革蘭染色陽性。雖然健康人可帶有念珠菌，但并不發(fā)病，當(dāng)宿主防御功能降低以后，這種非致病性念珠菌轉(zhuǎn)化為致病性念珠菌，故念珠菌為條件致病菌[20]?？谇恍l(wèi)生情況的惡化及各種原因?qū)е碌钠つw黏膜屏障作用降低，如艾滋病、長期使用廣譜抗生素、放療后、糖皮質(zhì)激素的長期應(yīng)用等，機(jī)體可能受到念珠菌性口炎的困擾[21]。Koga等[22]運(yùn)用針對念珠菌的培養(yǎng)方法發(fā)現(xiàn)口臭患者舌苔樣本的念珠菌陽性檢出率為25.2%，且白色念珠菌為最高檢出率的菌種。同時在白色念珠菌強(qiáng)陽性的個體中，甲基硫醇的濃度也較高。

1.5 其他厭氧菌

包括纖毛菌(G-)、消化鏈球菌(G+)、梭桿菌(G-)、韋榮球菌(G-)、放線菌(G+)、真桿菌(G+)等。

Ren、Takeshita等[19,23]運(yùn)用細(xì)菌16S rRNA基因測序方法均發(fā)現(xiàn)纖毛菌在口臭組唾液或舌苔樣本中的相對豐度顯著高于對照健康組。Ren、Takeshita等[19,23]通過比較口臭組和對照組唾液或舌苔細(xì)菌樣本，發(fā)現(xiàn)消化鏈球菌在口臭組中含量顯著高于對照組。Takeshita等[23]比較了口臭組和健康對照組唾液樣本中細(xì)菌，分析表明梭桿菌的含量在口臭組中顯著較高；Ebrahim-Saraie等[24]也研究發(fā)現(xiàn)相較正常人群，口臭組牙周袋中的梭桿菌檢出率更高。Haraszthy等[25]對口臭組和健康對照組舌苔上細(xì)菌的研究顯示韋榮球菌在口臭人群中含量較高。Haraszthy、Ren等[25-26]在檢測了口臭組和健康對照組舌苔及齦上菌斑中細(xì)菌差異后，發(fā)現(xiàn)放線菌在口臭組中占更高比重。Takeshita、Haraszthy等[23,25]研究發(fā)現(xiàn)口臭組舌苔和唾液樣本中的真桿菌所占比例顯著高于健康對照組。

2 口源性口臭的VSC產(chǎn)生機(jī)制

致臭氣體大部分為細(xì)菌分解含硫氨基酸得到的揮發(fā)性含硫化合物(VSCs)。VSC包括硫化氫(H2S)、甲基硫醇(CH3SH)和二甲基硫醚。在口源性口臭中，硫化氫和甲基硫醇為主要的致臭氣體，二甲基硫醚為非口源性口臭中主要的致臭氣體[27]。Sterer提出口臭的產(chǎn)生包括了兩步驟：①糖蛋白的去糖基化；②蛋白質(zhì)核心的水解和氨基酸的利用，產(chǎn)生VSC[28]。

2.1 糖蛋白的去糖基化

即移去碳水化合物的側(cè)鏈。糖蛋白的碳水化合物側(cè)鏈分解由一系列糖苷酶催化，包括β-半乳糖苷酶、β-N-乙?；肴樘擒彰?、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。Sterer等對含有β-半乳糖苷酶的唾液在有或沒有糖苷抑制劑的條件下預(yù)培養(yǎng)。結(jié)果顯示：外源性添加糖苷酶β-半乳糖苷酶可以促進(jìn)唾液糖蛋白的降解，該過程伴隨著VSC的產(chǎn)生；而糖苷抑制劑可以抑制這種作用[28]。Yoneda等也研究發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶活性與口臭強(qiáng)度(感官計分、便攜式硫化物檢測器計分和VSC濃度)正相關(guān)，且與舌苔覆蓋的面積和厚度相關(guān)。這些研究結(jié)果提示：唾液糖蛋白的去糖基化是后續(xù)水解蛋白質(zhì)的細(xì)菌降解糖蛋白的重要前提步驟[29]。研究發(fā)現(xiàn)綠茶中的茶多酚可以通過劑量依賴性地抑制S.moorei中的β-半乳糖苷酶，從而降低口臭的程度[30]。Sterer等[28]在后續(xù)研究中指出了革蘭陽性和革蘭陰性細(xì)菌在產(chǎn)生VSC中的確切作用，闡述了革蘭陽性細(xì)菌在生物膜的外表面產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，催化了糖蛋白的去糖基化；而革蘭陰性細(xì)菌在生物膜的深層中分解含硫氨基酸產(chǎn)生VSC?？谇桓锾m陰性厭氧菌常常被認(rèn)為是口臭的唯一來源。但是，生物膜外表面的革蘭陽性且能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶的細(xì)菌也參與到口臭的產(chǎn)生這一可能，對解釋之前觀察到的數(shù)種針對革蘭陽性菌的抗生素及僅針對口腔生物膜表層的漱口水對口臭降低有效這一事實有幫助[31]。且患者口腔中β-半乳糖苷酶含量的檢測或可成為診斷口臭的方法之一。

2.2 含硫氨基酸分解產(chǎn)生H2S和CH3SH

2.2.1 H2S的產(chǎn)生

細(xì)菌產(chǎn)硫化氫主要是降解含硫氨基酸，根據(jù)參與的酶不同，最終代謝產(chǎn)物也不同。半胱氨酸降解的其中一條通路是依賴5′磷酸吡哆醛輔酶的L-半胱氨酸脫巰基酶參與的，含α，β消除活性，產(chǎn)物為硫化氫、丙酮酸和氨。很多口腔細(xì)菌基因組都可編碼產(chǎn)生L-半胱氨酸脫巰基酶，如具核梭桿菌中的cdl基因，齒垢密螺旋體中的hly基因，中間普氏菌中的lcs基因。此外，咽峽炎鏈球菌和中間鏈球菌可以利用由其基因組中的lcd基因編碼產(chǎn)生胱硫醚酶分解L-胱硫醚和半胱氨酸產(chǎn)生硫化氫[32]。Basic等將多種厭氧菌在含L-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)而檢測其產(chǎn)生硫化氫的量，結(jié)果顯示梭桿菌屬產(chǎn)生硫化氫的速率最快且量最大，Tannerae普氏菌能產(chǎn)生大量的硫化氫，齒垢密螺旋體亦能在較慢的速率下產(chǎn)生大量硫化氫[33]。

2.2.2 CH3SH的產(chǎn)生

L-甲硫氨酸-α-脫氨基-γ-巰基乙醇-裂解酶(METase)通過α，γ消除作用，分解甲硫氨酸產(chǎn)生甲基硫醇，其他產(chǎn)物包括α-丁酮酸、氨。Yoshimura等[34]研究發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌具有產(chǎn)甲基硫醇的能力，mgl基因編碼產(chǎn)生牙齦卟啉單胞菌W83株的METase酶。mgl基因約1 200 bp，編碼43.3 ku的蛋白即METase酶，且人為破壞mgl基因而造成METase酶缺失的變異株產(chǎn)生甲基硫醇的量明顯下降。Ouhara等也研究發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌產(chǎn)生甲基硫醇的量與mglmRNA表達(dá)的量成正相關(guān)[35]。

3 總 結(jié)

綜上所述，隨著細(xì)菌檢測技術(shù)的發(fā)展，與口源性口臭相關(guān)的微生物逐漸明了，除了公認(rèn)的牙周致病菌外，S.moorei、唾液鏈球菌、念珠菌及其他一些口腔厭氧菌與口臭關(guān)聯(lián)的證據(jù)逐漸積累了起來。不同研究對于口臭相關(guān)細(xì)菌菌群結(jié)論的差異主要源自兩個方面：細(xì)菌檢測的方法差異、研究對象是否納入牙周病患者。VSC(可揮發(fā)性含硫化合物)中的硫化氫和甲基硫醇作為口源性口臭的主要產(chǎn)臭氣體，它們的產(chǎn)生機(jī)制主要包括了糖蛋白的去糖基化和含硫蛋白的降解這兩個重要步驟。這兩個步驟又與細(xì)菌的作用密切相關(guān)，糖蛋白的去糖基化主要依賴革蘭陽性細(xì)菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶；而含硫蛋白的降解主要依賴革蘭陰性細(xì)菌的L-半胱氨酸脫巰基酶分解半胱氨酸產(chǎn)生硫化氫和L-甲硫氨酸-α-脫氨基-γ-巰基乙醇-裂解酶分解甲硫氨酸產(chǎn)生甲基硫醇。這些機(jī)制的厘清，對口臭的治療具有一定指導(dǎo)意義。