肝泡型包蟲病侵及膽道患者膽汁外泌體microRNA的檢測及生物信息學(xué)分析

王志鑫，茍 平，于文昊, 任 利，陽丹才讓，王海久，樊海寧

1 青海大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽胰外科 西寧 810000； 2 青海省包蟲病重點實驗室，西寧 810000；3 成都京東方醫(yī)院 普通外科，成都 610000

泡型包蟲病為多房棘球蚴感染致病，它以浸潤方式增殖，類似腫瘤，可不斷產(chǎn)生新囊泡，直接侵犯鄰近的組織結(jié)構(gòu)(如肝臟Glisson鞘)。臨床上?？捎^察到肝泡型包蟲病(hepatic alveolar echinococcosis，HAE)患者出現(xiàn)黃疸進(jìn)行性加重、反復(fù)感染以及各肝門部重要管道結(jié)構(gòu)受侵等表現(xiàn)。這類患者預(yù)后較差，肝移植成為了最后選擇[1]。膽汁作為一種非循環(huán)體液，蘊(yùn)含豐富的膽道疾病信息，且局部囊泡的濃度高，幾乎不受遠(yuǎn)隔器官病變的影響[2-3]。本研究以HAE侵及膽道患者膽汁中外泌體為對象，進(jìn)行microRNA(miRNA)表達(dá)譜芯片實驗及生物信息學(xué)分析，探索HAE侵及膽道的相關(guān)機(jī)制，為改善此類患者預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集自2017年8月-2018年10月就診于青海大學(xué)附屬醫(yī)院，經(jīng)包蟲IgG抗體試驗、腹部CT/MRI檢查診斷為HAE的12例患者膽汁樣本。觀察組(A組，n=6)：有膽道受侵表現(xiàn)[4-5][有阻塞性黃疸；CT/磁共振胰膽管造影(MRCP)提示肝內(nèi)包蟲占位病灶鄰近主要膽道分支且二者關(guān)系密切，相應(yīng)區(qū)段肝內(nèi)膽管明顯擴(kuò)張]，為經(jīng)皮經(jīng)肝膽管引流術(shù)(percutaneous transhepatic cholangial drainage，PTCD)穿刺后第1天收集；對照組(B組，n=6)：無膽道受侵表現(xiàn)(無阻塞性黃疸；CT/MRCP提示肝內(nèi)包蟲占位病灶鄰近區(qū)段膽管無擴(kuò)張)，為全麻手術(shù)入腹后穿刺膽囊收集。

1.2 研究方法

1.2.1 膽汁樣本收集與保存 經(jīng)全麻術(shù)中或PTCD穿刺后第1天收集膽汁樣本。收集后經(jīng)4000×g離心15 min后，吸取上層澄清部分置于-80 ℃冰箱凍存。過程中嚴(yán)格無菌操作，凍存后避免樣本反復(fù)凍融，且保證只在提取外泌體時才被解凍。

1.2.2 膽汁樣本中外泌體RNA提取及質(zhì)檢 將上述膽汁樣本送至上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，使用超速離心機(jī)(美國Thermo公司)提取并經(jīng)Western Blot鑒定膽汁樣本中外泌體結(jié)構(gòu)后，用Trizol試劑(美國Thermo公司)提取各樣本外泌體總RNA，經(jīng)Nanodrop 2000(超微量紫外分光光度計，美國Thermo公司)測定各樣本總RNA濃度，對滿足芯片實驗上樣需要(130～1000 ng)的樣本進(jìn)行miRNA表達(dá)譜芯片實驗。

1.2.3 miRNA表達(dá)譜芯片實驗 使用RNA Labeing Kit及GeneChip miRNA 4.0(美國Affymetrix公司)分析獲得miRNA表達(dá)譜。以|Fold Change|>2作為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異miRNA。

1.2.4 差異miRNA的生物學(xué)信息分析 兩組比較，若差異miRNA表達(dá)上調(diào)，定義差異表達(dá)倍數(shù)Fold Change=觀察組/對照組；若表達(dá)下調(diào)，則定義Fold Change=-對照組/觀察組。以|Fold Change|>2作為顯著性差異的篩選標(biāo)準(zhǔn)。選擇差異倍數(shù)最大的10個miRNAs，在Targetscan、miRNA.ORG和miRDB三個數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行靶基因預(yù)測，選取Count數(shù)(即該基因在數(shù)據(jù)庫中被預(yù)測到的頻次)為3的基因作為該miRNA的靶基因，以提高可信度。以錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR，即P值經(jīng)Fisher精確檢驗后，再經(jīng)Benjamini-Hochberg校正所得)<0.05為顯著性指標(biāo)，進(jìn)行Pathway分析及GO注釋富集分析。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審批(批號：P-SL-2019072)。

2 結(jié)果

2.1 外泌體標(biāo)志性蛋白檢測 提取膽汁中外泌體后，經(jīng)Western Blot檢測外泌體標(biāo)志性蛋白(CD63、CD9、TSG101)。結(jié)果顯示，兩組樣本中均檢測到不同表達(dá)程度的標(biāo)志性蛋白，證實各膽汁樣本中外泌體客觀存在(圖1)。

2.2 芯片數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估

2.2.1 信號強(qiáng)度分布統(tǒng)計 圖2顯示各樣本芯片探針的信號強(qiáng)度重合度好，芯片實驗可靠性高。

2.2.2 相對對數(shù)信號強(qiáng)度統(tǒng)計 圖3顯示各樣本相對對數(shù)信號強(qiáng)度箱線圖的分布相近，數(shù)據(jù)的重復(fù)性好，芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量較好。

2.3 miRNA的顯著性差異分析 經(jīng)miRNA表達(dá)譜芯片實驗后，以|Fold Change|>2作為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)，篩選表達(dá)差異miRNA。結(jié)果顯示，A組與B組比較，共有74個顯著差異表達(dá)的miRNAs，其中9個表達(dá)上調(diào)，65個表達(dá)下調(diào)(表1)。

2.4 顯著性差異miRNA的生物信息分析

2.4.1 靶基因預(yù)測 選擇差異倍數(shù)最大的10個miRNAs，進(jìn)行靶基因預(yù)測。選取Count數(shù)量為3的基因作為該miRNA的靶基因。結(jié)果共預(yù)測到45個靶基因，包括AFF3、STK4、PIK3R1、PTEN等(表2)。

2.4.2 相關(guān)信號通路分析 通過基于KEGG & BioCarta的通路注釋及富集分析發(fā)現(xiàn)，A組相較于B組，靶基因主要在腫瘤發(fā)生(pathways in cancer)、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)(phosphatidylinositol signaling system)、PTEN、AKT等通路中顯著富集表達(dá)，預(yù)示HAE侵及膽道后，顯著影響了這些通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程(圖4)。

2.4.3 GO注釋 經(jīng)GO注釋發(fā)現(xiàn)，A組相較于B組，靶基因主要在GO-BP方面富集表達(dá)，預(yù)示著HAE侵及膽道后，顯著影響了包括基因抑制的正向調(diào)控(positive regulation of gene repression)、調(diào)控細(xì)胞分化(regulation of cell differentiation)等在內(nèi)的生物過程(圖5)。

表1 74個顯著差異miRNAs及表達(dá)情況

表2 靶基因預(yù)測結(jié)果

3 討論

外泌體是具代表性的一類囊泡結(jié)構(gòu)，它是由多種細(xì)胞在生理或病理狀態(tài)下分泌的一種微小囊泡，含大量與其來源和功能密切相關(guān)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等物質(zhì)[6]。miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子，是轉(zhuǎn)錄后機(jī)制的重要調(diào)節(jié)因素，它主要通過參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控實現(xiàn)對靶基因的表達(dá)調(diào)控，從而影響各種生命活動進(jìn)程[7]。在宿主-寄生蟲相互作用過程中，外泌體miRNA起著重要的調(diào)節(jié)作用。宿主被蠕蟲感染后，相關(guān)宿主細(xì)胞或組織中miRNA失去了調(diào)節(jié)功能，預(yù)示miRNA這種功能變化導(dǎo)致了寄生蟲感染、致病宿主的病理過程[8]。寄生性絳蟲分泌的細(xì)胞外囊泡包含有miRNA及免疫診斷性蛋白等物質(zhì)成分[9]。miRNA不同于基因或蛋白，它具有時空性或階段性特點，即在同一疾病不同狀態(tài)下其表達(dá)量存在差異。本研究以差異倍數(shù)|Fold Change|>2作為篩選差異miRNA的主要指標(biāo)。經(jīng)miRNA表達(dá)譜芯片分析得出差異顯著的10個miRNAs分子，可作為診斷HAE侵及膽道的生物學(xué)標(biāo)志物。因此可以預(yù)測，當(dāng)包蟲病灶侵犯膽道后，人體分泌、釋放的外泌體及外泌體中的包裹物(如miRNA)也隨之受到影響。通過分析HAE侵犯膽道后膽汁中外泌體miRNA的表達(dá)特征，篩選出差異顯著的miRNA作為膽道受侵生物標(biāo)記物，可為后期臨床應(yīng)用微流控等床旁檢測儀分析膽道穿刺液或引流液中外泌體特異性miRNA奠定實驗基礎(chǔ)。在分析膽汁外泌體差異miRNA的基礎(chǔ)上，可結(jié)合膽道造影、CT、MRCP等進(jìn)行術(shù)前規(guī)劃、風(fēng)險評估。若上述依據(jù)支持包蟲病灶累及主要膽道，則需考慮術(shù)中對侵犯部位膽道進(jìn)行完整切除及重建可能，或者在面臨包蟲病灶不可切除的情形下(如合并重要血管的侵犯)，為選擇姑息手術(shù)抑或等待肝移植等治療方案時提供臨床抉擇，因此具有臨床指導(dǎo)意義。

Masyuk等[10]研究表明，膽汁中外泌體與膽管細(xì)胞纖毛相互作用時，會影響ERK1/2(細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶)信號通路而使miRNA-15a表達(dá)增加，進(jìn)而導(dǎo)致膽管細(xì)胞增殖減少。這反應(yīng)出膽汁中外泌體miRNA通過調(diào)控信號通路活動水平而影響某些生理或病理過程。本研究對上述差異顯著的10個miRNAs分子進(jìn)行靶基因預(yù)測，共預(yù)測到45個靶基因。經(jīng)基于KEGG & BioCarta的通路富集分析[11]顯示，上述靶基因在腫瘤發(fā)生、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、黑色素瘤、PTEN等通路中富集程度較高，預(yù)示HAE侵及膽道后顯著影響了上述通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或代謝過程。經(jīng)GO注釋[12]及富集分析顯示，靶基因主要在GO-BP方面富集表達(dá)，預(yù)示HAE侵及膽道后顯著影響了包括基因抑制的正向調(diào)控、調(diào)控細(xì)胞分化、生殖系統(tǒng)發(fā)生發(fā)展等在內(nèi)的生物過程。

本研究的不足在于實驗樣本量較少，未進(jìn)行qPCR驗證差異miRNA及靶基因。實際情況歸因于膽汁樣本的取材較困難，只能經(jīng)PTCD或在包蟲病灶聯(lián)合膽囊切除術(shù)中穿刺膽囊的途徑獲得，可在取材過程中無菌操作。尚有部分晚期HAE患者放棄臨床治療，不能經(jīng)上述途徑收集膽汁樣本，造成了部分符合入組標(biāo)準(zhǔn)的病例流失。后期需繼續(xù)收集符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的膽汁樣本，并經(jīng)qPCR擴(kuò)增、驗證差異的miRNA。