二甲雙胍激活腺苷酸活化蛋白激酶抑制心肌缺氧再灌注損傷介導(dǎo)的NOD 樣受體蛋白3炎癥體活化的研究

楊柳，余鵬，鄒芳，蔡霞，黃艷婷，施星，時曼瑩，張勤，江艷娟，賴曉陽

炎癥在心肌缺血再灌注（I/R）損傷中發(fā)揮著重要作用[1-2]。NOD 樣受體蛋白3（NLRP3）炎性體作為免疫炎癥反應(yīng)的參與者，與心血管疾病關(guān)系密切。已有研究證實，NLRP3 炎性體通過多種途徑參與心肌缺血再灌注損傷、心肌病、心律失常及冠心病等疾病的發(fā)生、發(fā)展[3]。細(xì)胞凋亡、壞死或炎癥均可導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體三磷酸腺苷（ATP）水平的顯著下降，進而激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）[4]。AMPK在細(xì)胞能量代謝和信號通路激活等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且在多種藥物抵抗心肌I/R損傷中發(fā)揮重要作用[5]。大量基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍預(yù)處理或后處理通過激活A(yù)MPK及其介導(dǎo)下游信號通路有效減輕心肌I/R損傷[6]。二甲雙胍是否可以通過激活A(yù)MPK抑制NLRP3炎癥體對心肌發(fā)揮保護作用，尚不清楚。本研究擬采用二甲雙胍后處理心肌離體缺氧再灌注（H/R）損傷的大鼠模型模擬I/R損傷，探討二甲雙胍介導(dǎo)AMPK激活在抵抗心肌H/R損傷時對細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥體作用及機制。

1 材料與方法

實驗分組與處理：選擇健康雄性清潔級SD大鼠，體重180～230 g，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。取健康大鼠64只，進行麻醉，開胸直接取心臟，將心臟懸掛在Langendoff灌注裝置上建立離體心肌缺氧再灌注模型。隨機分為4組：持續(xù)灌注組、缺氧再灌注（H/R）組、二甲雙胍后處理組（MET組）、二甲雙胍后處理+AMPK抑制劑（compound C，CC）組（MET+CC組），每組16只。除持續(xù)灌注組持續(xù)灌流3 h外，其余組均先平衡30 min，然后停止灌流30 min，建立離體心肌缺血模型，再持續(xù)灌注2 h。MET組及MET+CC組進行后處理：MET組與MET+CC組分別在停止灌流后將二甲雙胍（50 μM）及二甲雙胍聯(lián)合復(fù)合物C（10 μM）混入K-H液灌注15 min，后繼續(xù)予以K-H液灌注105 min。

Langendorff離體心肌IR模型制備：根據(jù)本課題組之前的研究配置K-H液[7]：NaCl 118.0 mmol/L/、KCl 4.8 mmol/L、KH2PO41.2 mmol/L、NaHCO325.0 mmol/L、MgSO41.2 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L和葡萄糖11.0 mmol/L。將PH值調(diào)至7.35～7.45，并預(yù)先通入95%O2和5%CO2的混合氣體30 min，使K-H液與氣體充分混合，保持循環(huán)溫度為37℃。在大鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉及股靜脈注入肝素（500 U/kg）肝素化后，迅速開胸取心臟，將其置于4℃ K-H液中，排盡殘血后懸掛于Langendoff灌注裝置上。K-H緩沖液在恒壓80 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）、恒溫37℃下持續(xù)灌注，并吹入95%O2和5%CO2混合氣體，通過左心房切口向左心室插入一個與傳感器相連的乳膠球囊，向球囊內(nèi)注水，維持壓力于0～10 mmHg。并且利用生物信號采集處理系統(tǒng)（U/4C501H Med Lab，中國上海）采集缺血前即刻（T0）與再灌注30 min（T1）、60 min（T2）、90 min（T3）和120 min（T4）各時間點的血流動力學(xué)指標(biāo)：心率（HR）、左心室峰壓（LVSP）和左心室舒張末期壓力（LVEDP）。

心肌梗死面積測定：再灌注結(jié)束時，立即迅速取下Langendoff灌注裝置上的心臟。冷凍（-80 ℃）5 min后，用心臟切割器制成5～6塊2 mm厚的組織，置于1% TTC（批號：T8877，Sigma公司，美國）均勻染色。避光、恒溫下孵育20 min并于磷酸緩沖鹽溶液（PBS，成分為 NaCl、Na2HPO4、KCl、KH2PO4，pH=7.35）沖洗后，10%甲醛液（福爾馬林）固定24 h。梗死區(qū)及非梗死區(qū)分別被染為灰白色和磚紅色。用Alpha View凝膠圖像軟件評估左心室梗死體積/左心肌總體積（即心肌梗死面積）。

心肌組織原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）染色測定心肌凋亡：在4℃條件下，多聚甲醛（4%）固定大鼠心肌組織，乙醇脫水、石蠟包埋后進行切片。先用PBS沖洗2遍，按照試劑盒操作步驟，加TUNEL混合溶液，37℃避光孵育1 h。續(xù)用4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）對比染色細(xì)胞核，室溫下孵育10 min，PBS沖洗2遍。熒光顯微鏡下觀察并拍照，TUNEL染色呈綠色熒光為凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，心肌細(xì)胞凋亡率=凋亡心肌細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。

心臟組織病理染色：于再灌注結(jié)束時，立即切取1 mm3左心室置于4% 多聚甲醛固定，制備冷凍切片。將大鼠心臟組織用4%多聚甲醛溶液浸泡24 h以上，乙醇脫水、石蠟包埋處理后切片制成厚4～6 μm的切片，進行常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色和馬松（MASON）染色，于200倍鏡下觀察心臟形態(tài)學(xué)變化。

心肌組織酶含量測定：大鼠心臟缺氧再灌注2 h后，取左心室組織，生理鹽水制成10%組織勻漿液，離心（4℃、3 000 r/min）15 min后取上清液，利用全自動生化分析儀（Olympus公司，日本）測定乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量。

免疫蛋白印記（Western blot）法測定蛋白表達(dá)：于再灌注末迅速取下H/R損傷模型制備成功的左心室心肌組織，剪碎，TBST溶液洗滌2次，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，低溫下勻漿混勻（1 2000 r/min），離心10 min（4℃，r=210 mm），取上清液，二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白含量后，制成蛋白樣品。取蛋白樣品30 μg，與PBS緩沖液充分混勻，浴熱5 min。經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)印、封閉后，分別加入一抗磷酸化AMPK（1:1 000）（批號：sc-33437，CST公司，美國）、一抗AMPK（1:1 000）（批號：sc-8312，CST公司，美國）、一抗NLRP3（1:1 000）（批號：ab214185，abcam公司，美國）、一抗活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（caspase-1）（1:1 000）（批號：89332，CST公司，美國）、一抗白細(xì)胞介素（IL）-1β（1:1 000）（批號：12242，CST公司，美國）、和內(nèi)參抗-甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH；1:2 000；批號：sc-492，CST公司，美國），一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2h。經(jīng)洗滌、顯影、灰度掃描后，用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值反映蛋白的表達(dá)。

統(tǒng)計學(xué)處理：采用Graph Pad Prism 7.00軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血流動力學(xué)指標(biāo)比較（表1）

各組間T0時LVSP、HR和LVEDP差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）；與T0比較，除持續(xù)灌注組外，其他各組T1～T4時LVSP和HR降低，LVEDP升高（P均＜0.05）；在T1～T4四個時間點，與持續(xù)灌注組比較，其他各組LVSP和HR均降低，LVEDP升高（P均＜0.05）；與H/R組比較，MET組LVSP和HR升高，LVEDP降低（P均＜ 0.05）；與MET組比較，增加AMPK抑制劑的MET+CC組LVSP、HR降低，LVEDP升高（P均＜ 0.05）。

表1 各組心肌缺氧再灌注期間的血流動力學(xué)指標(biāo)（±s）

表1 各組心肌缺氧再灌注期間的血流動力學(xué)指標(biāo)（±s）

注：AMPK：腺苷酸活化蛋白激酶；H/R組：缺氧再灌注組；MET組：二甲雙胍后處理組；MET+CC組：二甲雙胍后處理+AMPK抑制劑組。與T0時比較 *P＜0.05；與持續(xù)灌注組比較△P＜0.05；與H/R組比較▲P＜0.05；與MET組比較＃P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa

2.2 心肌梗死面積和LDH、CK-MB水平比較（表2）

與持續(xù)灌注組比較，H/R組心肌梗死面積增加（P＜0.05）；與H/R組比較，MET組心肌梗死面積減少（P＜0.05）；與MET組比較，MET+CC組心肌梗死面積增加（P＜0.05）；與持續(xù)灌注組比較，H/R組LDH和CK-MB水平均顯著增加（P均＜0.05）；與H/R組比較，MET組LDH與CK-MB水平均顯著下降（P均＜0.05）；與MET組比較，MET+CC組LDH與CK-MB水平顯著升高（P均＜0.05）。

2.3 病理組織染色與TUNEL染色（圖1）

HE染色顯示持續(xù)灌注組心肌組織結(jié)構(gòu)清楚，心肌細(xì)胞排列整齊，未見心肌細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤及纖維增生；H/R組心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞膨大，其間可見小血管擴張、充血，大量炎癥細(xì)胞浸潤及纖維增生；與H/R組比較，MET組心肌組織結(jié)構(gòu)較清楚，心肌損傷較輕，心肌間質(zhì)少量炎癥細(xì)胞以及心肌間膠原纖維堆積，其間小血管擴張、充血較輕；而MET+CC組心肌組織損害情況則介于IR組與MET組之間（圖1A）。利用MASON染色檢測各組心肌間質(zhì)膠原沉積，光鏡下觀察可見，持續(xù)灌注組心肌間質(zhì)僅見少量膠原沉積；H/R組膠原沉積較持續(xù)灌注組顯著增多；MET組與H/R組比較，心肌間膠原纖維堆積明顯減少；MET+CC組心肌組織膠原陽性染色較MET組明顯增多（圖1B）。

表2 各組心肌梗死面積和LDH、CK-MB水平（±s，n=6）

表2 各組心肌梗死面積和LDH、CK-MB水平（±s，n=6）

注：LDH：乳酸脫氫酶；CK-MB：肌酸激酶同工酶；AMPK：腺苷酸活化蛋白激酶。H/R組：缺氧再灌注組；MET組：二甲雙胍后處理組；MET+CC組：二甲雙胍后處理+AMPK抑制劑組。與持續(xù)灌注組比較*P＜0.05；與H/R組比較△P＜0.05；與MET組比較▲P＜0.05

圖1 再灌注末各組心肌組織病理改變和心肌組織壞死程度（×200）

2.4 各組大鼠心肌組織TUNEL染色及凋亡率（圖2）

TUNEL染色結(jié)果顯示，與持續(xù)灌注組相比，IR組心肌組織內(nèi)綠色熒光明顯增多，心肌細(xì)胞凋亡增加（P＜0.05）；而MET組較IR組綠色熒光顯著減少，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低（P＜0.05）。MET+CC組較MET組心肌組織內(nèi)綠色熒光增多，心肌細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）。

2.5 各組大鼠心肌組織內(nèi)AMPK/NLRP3通路相關(guān)蛋白及IL-1β水平變化（圖3）

與持續(xù)灌注組比較，H/R組心肌內(nèi)磷酸化AMPK、NLRP3、活化caspase-1和IL-1β的表達(dá)均增加（P均＜0.05）；而進一步與持續(xù)灌注組和H/R組相比，MET組心肌內(nèi)磷酸化AMPK/AMPK比值明顯升高（P＜0.05），而NLPR3、活化caspase-1和IL-1β表達(dá)水平明顯降低（P均＜0.05）；與MET組相比，MET+CC組心肌內(nèi)磷酸化AMPK/AMPK比值顯著降低（P＜0.05），NLPR3、活化caspase-1和IL-1β表達(dá)水平均升高（P均 ＜ 0.05）。

圖2 再灌注末各組心肌組織TUNEL染色及心肌細(xì)胞凋亡率比較

圖3 各組大鼠心肌組織內(nèi)磷酸化AMPK、NLRP3、活化caspase-1和白細(xì)胞介素-1β蛋白表達(dá)水平（±s，n=3）和白細(xì)胞介素-1β含量測定（±s，n=6）

3 討論

本實驗通過觀察Langendorff模型制備成功的離體大鼠心臟血流動力學(xué)指標(biāo)，并測定心肌梗死面積、心肌損傷相關(guān)酶LDH及CK-MB的含量等來監(jiān)測各組大鼠心肌H/R損傷。研究表明，MET組較H/R組血流動力學(xué)指標(biāo)明顯改善、心肌梗死面積減小、LDH和CK-MB含量下降，結(jié)果證實二甲雙胍可有效降低心肌H/R損傷。此外，再給予AMPK抑制劑后，相比MET組，MET+CC組大鼠心臟的血流動力學(xué)指標(biāo)顯著惡化，心肌梗死面積增大，LDH和CK-MB含量升高。進一步利用HE染色觀察心肌組織細(xì)胞，結(jié)果顯示二甲雙胍后處理降低了心肌炎癥細(xì)胞及纖維細(xì)胞浸潤數(shù)量，減輕心肌細(xì)胞水腫及間質(zhì)充血程度；MASON染色結(jié)果提示心肌缺氧再灌注損傷導(dǎo)致心肌組織間質(zhì)膠原沉積明顯增多，二甲雙胍后處理可顯著減少心肌組織膠原沉積。TUNEL染色結(jié)果H/R組心肌凋亡率明顯升高，二甲雙胍后處理可顯著降低心肌凋亡率，再次驗證了二甲雙胍對心肌H/R損傷的保護作用，提示二甲雙胍減少H/R損傷所致組織壞死及心肌細(xì)胞凋亡，而該保護作用可被AMPK抑制劑所消除。與最新研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍通過激活A(yù)MPK有效減少H/R損傷。

AMPK是一種AMP依賴的蛋白激酶，幾乎存在于哺乳動物所有組織細(xì)胞中，其不僅在調(diào)節(jié)能量和物質(zhì)代謝起著重要作用，而且參與細(xì)胞增殖、凋亡、自噬，炎癥等多種生物學(xué)功能。藥物或缺血預(yù)處理等方式通過激活的AMPK及下游信號通路，發(fā)揮調(diào)節(jié)能量代謝、減輕心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、抑制心肌凋亡和調(diào)節(jié)自噬等多種機制對心肌H/R損傷發(fā)揮保護作用[8-10]。本研究采用二甲雙胍后處理心肌缺氧再灌注損傷的大鼠模型，通過測定AMPK蛋白水平，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍激活A(yù)MPK有效抑制H/R損傷誘導(dǎo)心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡。已有大量研究證實，炎癥反應(yīng)能夠加重心肌缺血再灌注或缺氧復(fù)氧損傷的組織壞死及凋亡，NLRP3炎癥體在其中發(fā)揮重要作用[11]。

作為炎癥體NOD樣受體（NLR）家族中的代表之一，NLRP3是目前研究最為廣泛的炎癥復(fù)合蛋白體。NLRP3可被多種類型的分子、細(xì)菌及病毒所激活。NLRP3活化后其N-末端熱蛋白結(jié)構(gòu)域（PYD）與含有半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點狀蛋白質(zhì)（ACS）結(jié)合，同時聚集caspase-1形成NLRP3炎癥體[12]。在自身催化作用下caspase-1前體被激活，活化caspase-1可剪切IL-1β和IL-18的前體，隨后活化的IL-1β及IL-18等作為主要效應(yīng)因子，在炎癥中發(fā)揮重要作用，參與了心肌H/R發(fā)生發(fā)展[13-15]。Ma等[16]發(fā)現(xiàn)中成藥清開靈注射液可通過激活A(yù)MPK，抑制NLRP3炎癥體活化減輕炎癥反應(yīng)，在腦缺血再灌注損傷發(fā)揮有益作用。那么二甲雙胍對心肌H/R的保護作用是否通過激活A(yù)MPK抑制NLRP3炎癥體活化？通過Western blot法測定磷酸化AMPK、NLPR3、活 化caspase -1、IL-1β等蛋白的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍激活A(yù)MPK抑制NLRP3表達(dá)并顯著減少活化caspase-1和IL-1β水平，最終抑制NLRP3介導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥損傷。CC是一種有效的、可逆的、選擇性AMPK抑制劑，通過變構(gòu)調(diào)節(jié)和抑制AMPK在Thr172的磷酸化激活而發(fā)揮效應(yīng)。我們通過運用CC抑制AMPK激活后，研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍心肌保護作用顯著廢除，此外心肌細(xì)胞壞死程度顯著增加。進一步給予AMPK抑制劑CC處理后的NLPR3表達(dá)上調(diào)，并且活化caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)升高。圖1B所示CC抑制AMPK后心肌IR誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死顯著增加，因此我們的結(jié)果提示AMPK/NLPR3炎癥小體信號通路在二甲雙胍抗心肌H/R誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

綜上所述，二甲雙胍后處理可通過激活A(yù)MPK抑制NRPL3炎癥體活化進而減少IL-1β等炎癥因子水平，減少心肌梗死面積，改善心肌組織病理學(xué)損傷，抑制心肌細(xì)胞凋亡，最終發(fā)揮其對離體大鼠心肌H/R損傷的保護作用。因此，激活A(yù)MPK及其調(diào)控的NRPL3炎癥體活化可能為臨床防治缺血性心臟病提供潛在的治療靶點，并為二甲雙胍心肌保護的相關(guān)研究提供新的思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突