茶多酚對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

許明賢，唐瑞娣，張潔容，曹舒晴，秦理璐，肖嘉琪，王桂房

（廣州醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)學(xué)院生理教研室，2.基礎(chǔ)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，廣東 廣州 511436）

脂多糖（Lipopolysaccharides, LPS）是革蘭陰性細(xì)菌內(nèi)毒素主要成分，也是革蘭陰性細(xì)菌激發(fā)宿主免疫應(yīng)答，導(dǎo)致機(jī)體損傷的重要因素。人體聚集的革蘭陰性桿菌最豐富的部位是腸道。革蘭陰性菌感染時(shí)，可導(dǎo)致腎臟缺血、腎灌注減少及腎功能的改變，因細(xì)胞損傷凋亡、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙[4]和炎癥反應(yīng)等多種復(fù)雜的病理生理學(xué)機(jī)制導(dǎo)致急性腎損傷（acute kidney injury, AKI）。LPS 不僅可直接或間接地造成腎臟細(xì)胞損傷[5-7]，而且其誘導(dǎo)的腎細(xì)胞壞死在重癥腎炎的發(fā)展中起重要作用。茶多酚是從茶葉中提取出來(lái)的一種含多酚類化合物的混合物，包含多個(gè)酚羥基結(jié)構(gòu)，具有強(qiáng)大的抗氧化作用。多項(xiàng)研究表明，茶多酚還具有抗衰老、保護(hù)心腦血管、降血脂等作用[8-9]。本研究擬從氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)兩方面探討茶多酚對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑

無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)KM 雄性小鼠，體重（35± 3）g，購(gòu)自中山大學(xué)動(dòng)物中心；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）測(cè)試盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）測(cè)試盒、肌酐（Cr）測(cè)試盒、血尿素氮（BUN）測(cè)試盒及尿蛋白（Upro）定量測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，LPS 購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，茶多酚（純度98.35%，食品級(jí)）購(gòu)自陜西嘉禾生物科技股份有限公司。

1.2 動(dòng)物模型制備

24 只KM 雄性小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和茶多酚治療組（治療組），每組8 只。采用腹腔注射LPS（10 mg/kg）的方法復(fù)制小鼠AKI 模型[1-2]，假手術(shù)組注射同樣劑量生理鹽水。治療組于術(shù)前7 d 開(kāi)始用茶多酚溶液灌胃（200 mg/kg，1 次/d）[3]，其他兩組均用等量蒸餾水灌胃，1 次/d，持續(xù)8 d，正常飼食。

1.3 血尿生化指標(biāo)、細(xì)胞因子檢測(cè)和腎組織HE染色

眼球取血，分離血清測(cè)定BUN、血肌酐（Scr）、MDA、SOD 水平和GSH-Px 活性。留取模型復(fù)制后24 h 尿液，檢測(cè)BUN、Upro 和尿肌酐（Ucr）的水平。取小鼠雙側(cè)腎臟，冰生理鹽水洗去血液，用濾紙吸去表面水分，稱重并計(jì)算小鼠腎臟系數(shù)（腎臟重量/ 小鼠體重×100%）。隨后取部分腎臟，加入冰生理鹽水，冰上勻漿，低溫離心并取上清液檢測(cè)TNF-α 和IL-1β 的濃度，余下部分置于Bouin 液防腐，用蘇木精-伊紅（HE）染色，切片，光學(xué)顯微鏡（×400）下觀察腎組織損傷情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較用Duncan's 新復(fù)極差法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清和尿液BUN、Cr，Upro 水平及腎臟系數(shù)比較

3 組小鼠Scr、血BUN、Ucr、Upro、尿BUN 及腎臟系數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組和治療組小鼠Scr、血BUN、Ucr、Upro、尿BUN 水平及腎臟系數(shù)均提高（P＜0.05）。與模型組比較，治療組上述指標(biāo)降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 小鼠血清MDA、SOD 和GSH-Px 水平比較

3 組MDA、SOD 及GSH-Px 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組和治療組小鼠血清MDA 水平提高，SOD 和GSH-Px 水平下降（P＜0.05）。與模型組比較，治療組MDA 水平降低，而SOD 和GSH-Px 水平提高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 小鼠腎臟組織中TNF-α 和IL-1β 水平比較

3 組IL-1β 和TNF-α 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組和治療組小鼠腎組織IL-1β 和TNF-α 水平提高（P＜0.05）。與模型組比較，治療組IL-1β 和TNF-α 水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 小鼠腎臟組織HE 染色病理結(jié)果

腎臟組織HE 染色切片顯示，假手術(shù)組腎小球、腎曲管結(jié)構(gòu)正常清楚，腎間質(zhì)及腎小球無(wú)充血和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組相對(duì)于假手術(shù)組腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)變性壞死，腎小管出現(xiàn)蛋白管型，并明顯擴(kuò)張；腎間質(zhì)充血水腫并有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球可見(jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維素滲出。與模型組比較，治療組腎臟組織損傷情況明顯緩解。見(jiàn)圖1。

表1 3 組小鼠血清和尿液BUN、Cr、Upro 和腎臟系數(shù)比較 （n =8，±s）

表1 3 組小鼠血清和尿液BUN、Cr、Upro 和腎臟系數(shù)比較 （n =8，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別 Scr/（μmol/L） 血BUN/（mmol/L） Ucr/（μmol/L） Upro/（μmol/L） 尿BUN/（mmol/L） 腎臟系數(shù)/（g/kg）假手術(shù)組 15.12±1.83 5.38±0.43 1 758.93±262.14 1 144.38±132.54 261.04±49.31 1.15±0.08模型組 56.50±10.55① 49.38±8.63① 5 829.91±565.40① 2 755.83±257.18① 539.72±33.27① 1.58±0.07①治療組 35.47±7.95①② 29.95±3.10①② 3 239.73±304.18①② 2 075.29±183.87①② 302.23±37.50①② 1.23±0.05①②F 值 57.758 138.361 211.884 133.651 114.551 96.733 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 3 組小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 （n =8，±s）

表2 3 組小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 （n =8，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別 MDA/（nmol/L） SOD/（u/ml） GSH-Px/（u/ml）假手術(shù)組 5.22±0.77 15.55±2.16 58.65±1.28模型組 10.97±1.92① 10.46±1.14① 34.20±4.62①治療組 7.63±0.40①② 12.27±1.32①② 114.12±12.39①②F 值 45.356 18.217 199.670 P 值 0.000 0.000 0.000

表3 3 組小鼠腎臟組織炎癥因子比較 （n =8，pg/ml，±s）

表3 3 組小鼠腎臟組織炎癥因子比較 （n =8，pg/ml，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別 IL-1β TNF-α假手術(shù)組 33.49±2.30 32.59±1.11模型組 64.24±0.13① 55.12±1.06①治療組 56.05±0.38①② 49.49±1.36①②F 值 556.305 392.132 P 值 0.000 0.000

圖1 小鼠腎臟組織病理切片（HE 染色×400）

3 討論

LPS 進(jìn)入機(jī)體誘發(fā)膿毒血癥可引起全身多器官衰竭[5-6]，其中AKI 是膿毒血癥中常見(jiàn)的致死原因[10]。研究表明，內(nèi)毒素血癥時(shí)誘導(dǎo)白細(xì)胞（主要是中性粒細(xì)胞）表面黏附分子發(fā)生改變，被激活后產(chǎn)生大量超氧化物和一系列炎癥因子，形成級(jí)聯(lián)瀑布式炎癥反應(yīng)，主要通過(guò)自由基和炎癥因子作用引起局部組織細(xì)胞損傷[11-12]。同時(shí)氧化應(yīng)激改變線粒體膜的通透性，從而進(jìn)一步減少線粒體內(nèi)的氧化型輔酶（NAD）加重氧化應(yīng)激作用。根據(jù)DENG 等[13]的研究，實(shí)驗(yàn)中膿毒血癥AKI 是潛在、可逆的發(fā)病過(guò)程，即早期抗炎和/或抗氧化治療可以改善腎功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射LPS 可導(dǎo)致小鼠腎功能下降、腎臟系數(shù)增加、腎組織損傷；連續(xù)茶多酚灌胃給藥能改善腎功能，表現(xiàn)為血清BUN、Scr 水平下降，24 h 尿液BUN、Ucr 和Upro 水平下降，這些結(jié)果提示口服茶多酚可改善LPS 引起的腎功能損傷。

文獻(xiàn)表明LPS 引起AKI 的機(jī)制與自由基的產(chǎn)生、脂質(zhì)過(guò)氧化和炎癥反應(yīng)有重要關(guān)系[2，14]。MDA 是體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的重要產(chǎn)物，可間接反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度，是評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激水平的重要指標(biāo)。而SOD 可以清除體內(nèi)的氧自由基，可以緩解組織由于自由基導(dǎo)致的損傷，同時(shí)超氧化物可以影響SOD 的活性，組織損傷嚴(yán)重時(shí)SOD 功能減退甚至失活。GSH-Px 是機(jī)體重要的抗氧化劑和自由基清除劑，通過(guò)與自由基、重金屬等結(jié)合，從而把機(jī)體內(nèi)有害的毒物轉(zhuǎn)化為無(wú)害的物質(zhì)，排出體外。因此，SOD、GSH-Px 在機(jī)體的抗氧化作用方面有重大意義。本研究結(jié)果提示，治療組小鼠血清MDA 水平比模型組降低，血清中SOD 和GSH-Px水平提高，并且治療組血清GSH-Px 水平高于假手術(shù)組。提示茶多酚有上調(diào)正常機(jī)體GSH-Px 表達(dá)水平的作用，從而減少自由基的生成。治療組小鼠血清SOD的水平高于模型組，說(shuō)明茶多酚可以使小鼠血清SOD水平提高，從而緩解自由基對(duì)機(jī)體腎臟組織損傷起到保護(hù)作用。

IL-2 和TNF-α 均為組織細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子。IL-2 是由T 細(xì)胞分泌參與T 細(xì)胞分化和增殖的細(xì)胞因子，同時(shí)參加炎癥反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)。TNF-α 主要啟動(dòng)炎癥相關(guān)反應(yīng)通路，如NF-κB 信號(hào)通路。正常情況下，細(xì)胞因子組成動(dòng)態(tài)平衡的網(wǎng)絡(luò)。內(nèi)毒素可以作用于機(jī)體單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，誘導(dǎo)組織細(xì)胞產(chǎn)生一系列炎癥因子，如前列腺素、IL-1、TNF-α 等，各種炎癥因子參與一系列細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)，其中最重要的炎癥通路是Toll 樣受體4（TLR4）通路[13]，炎癥 因子相互促進(jìn)和誘發(fā)級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)。焦路陽(yáng)等[15]研究報(bào)道急性百草枯中毒大鼠的血清IL-2、IL-6 和TNF-α 水平升高，以上炎癥因子參與腎損傷的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。血清IL-2 和TNF-α 水平除用作反映機(jī)體炎癥反應(yīng)的指標(biāo)外，還可作為評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)中腎損傷治療效果的依據(jù)。治療組腎臟組織中IL-2 和TNF-α水平相比假手術(shù)組升高，同模型組比較降低，提示本研究中茶多酚可緩解LPS 導(dǎo)致的小鼠AKI。此外，茶多酚治療組的腎臟系數(shù)較模型組降低，腎臟HE 染色病理切片提示治療組腎小管腫脹和間質(zhì)水腫，但出血不明顯，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象程度也較模型組輕。

本實(shí)驗(yàn)中模型組相比假手術(shù)組BUN、Cr 和Upro水平升高，血清中MDA 水平上調(diào)，血清中SOD 和GSH-Px 水平降低，腎臟組織中IL-2 和TNF-α 水平均高于假手術(shù)組，說(shuō)明在LPS 作用下成功誘導(dǎo)小鼠AKI模型。治療組相比模型組腎功能改善，其作用機(jī)制與茶多酚的抗氧化應(yīng)激作用和抗炎癥反應(yīng)有關(guān)，與徐文萍等的研究結(jié)果[16]一致。我國(guó)茶葉資源豐富，茶多酚的來(lái)源廣泛，且毒副作用小，但在臨床應(yīng)用并不普遍。沈海濤等[3]的研究表明，茶多酚干預(yù)對(duì)百草枯大鼠腎臟有保護(hù)作用，且該作用在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。目前，國(guó)內(nèi)研究已經(jīng)證明茶多酚對(duì)多種毒物因氧化應(yīng)激等機(jī)制造成的急性損傷有保護(hù)作用[17]，根據(jù)歐春麗等[18]的研究，茶多酚口服給藥的安全性較好，小鼠的給藥量達(dá)到108 g/（kg·d）灌胃第7 天時(shí)仍未出現(xiàn)明顯急性毒性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)在給藥期間小鼠無(wú)明顯不良反應(yīng)，治療組小鼠相比模型組小鼠腎功能改善。

綜上所述，茶多酚預(yù)處理對(duì)LPS 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠AKI 有一定保護(hù)作用，其機(jī)制與茶多酚對(duì)抗氧化應(yīng)激和抑制腎臟炎癥反應(yīng)有關(guān)。