一種高抗性產(chǎn)海藻糖釀酒酵母菌株的開發(fā)*

孫同清

（青島啤酒（三水）有限公司，廣東佛山 528100）

酵母菌（Saccharomyces cerevisiae） 是自然界分布甚廣的一類真菌，為發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)的重要微生物，由于其具有生長迅速易培養(yǎng)的特點(diǎn)，在科學(xué)研究和生產(chǎn)實踐中有著廣泛的應(yīng)用。

海藻糖是一種非還原性二糖，廣泛存在于海藻、酵母、霉菌和食用菌等生物體內(nèi)，是一種貯藏性碳水化合物。海藻糖具有保護(hù)細(xì)胞核等物質(zhì)，在脫水、干燥、高溫、冷凍及高滲透壓等不良環(huán)境條件下活性免遭破壞的功能，是國際上最近開發(fā)的主要低聚糖之一。海藻糖在微生物細(xì)胞中的合成非常強(qiáng)烈。它的積累一般和生長速度的降低有關(guān)，特別是在分化過程和營養(yǎng)不足時，可由酶直接催化合成海藻糖。

若將酵母細(xì)胞置于饑餓條件下，其產(chǎn)海藻糖的量也會大大提高，當(dāng)海藻糖含量越高時，酵母細(xì)胞對干燥的抵抗力也明顯增強(qiáng)。在酵母的整個生命周期，海藻糖在再生階段積累，在出芽期間流動，生長速度降低促進(jìn)海藻糖的積累。

本文以高抗性產(chǎn)海藻糖釀酒酵母菌株ZGJ-4 為研究對象，從菌學(xué)特征、抗性研究、酵母菌ZGJ-4發(fā)酵制備海藻糖的工藝研究等三方面對ZGJ-4 的開發(fā)進(jìn)行了探討，全面分析ZGJ-4 的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗試劑

葡萄糖，分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；瓊脂，生化試劑，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙醇，分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；磷酸二氫鉀，分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鉀，分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；氯化鉀，分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；海藻糖，色譜純級標(biāo)準(zhǔn)品，SIGMA 公司。

1.1.2 試驗儀器

SYQ-DSX-280B，手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海申安；AR1140，電子精密天平，上海奧豪斯；THZ-C，恒溫振蕩器，江蘇太倉；SW-CJ-2D，雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化；PYX-190S-A，恒溫培養(yǎng)箱，廣東科力；UPT-I-10L，優(yōu)譜UPT 系列超純水器，上海優(yōu)譜；DNP-916BS-III，電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗；LC-2010HT，高效液相分析儀，日本島津SHIMADZU。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

斜面培養(yǎng)基與平板培養(yǎng)基（g/L）：豆芽汁100 mL（豆芽除頭除尾加熱30 min，用4～6 層紗布過濾），加10 g 葡萄糖，4 g 瓊脂制成培養(yǎng)基，在0.1 MPa、121 ℃條件下滅菌20 min。

液體培養(yǎng)基與種子培養(yǎng)基（g/L）：豆芽汁100 mL（豆芽除頭除尾加熱30 min，用4～6 層紗布過濾），加10 g 葡萄糖制成液體培養(yǎng)基，在0.1 MPa、121 ℃條件下滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：酵母膏45 g，蛋白胨15 g，（NH4）2SO415 g，葡萄糖60 g，制成3 L 發(fā)酵培養(yǎng)基，在0.1 MPa，121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2.2 產(chǎn)海藻糖酵母菌ZGJ-4 的菌學(xué)特性

將野生皺皮柑剝皮，榨汁，裝入瓶中。將自行發(fā)酵帶果香的皺皮柑汁液，吸取0.2 mL均勻涂布于裝有已滅菌斜面培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，28 ℃恒溫箱培養(yǎng)2 d 后，觀察菌落特征，其菌落生長良好，具有明顯酵母菌菌落特征，經(jīng)進(jìn)一步純化培養(yǎng)，選擇果香不太明顯、菌落形成較小、乳白色的菌體，在無菌操作臺上劃線進(jìn)一步接種于新鮮斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為36 ℃，培養(yǎng)3 d。待長出菌落后進(jìn)一步采用分區(qū)劃線法進(jìn)行純化，重復(fù)以上步驟3～5 次，直至分離出純單菌株。采用鏡檢和基因測序技術(shù)對菌學(xué)特征進(jìn)行描述。

1.2.3 產(chǎn)海藻糖酵母菌ZGJ-4 的抗性研究

1.2.3.1 酵母菌ZGJ-4 的抗酒精測試

采用平板培養(yǎng)基配方，在40 ℃時分別于培養(yǎng)基中加入2.0 mL、2.4 mL、2.8 mL、3.2 mL、3.6 mL、4.0 mL 無水乙醇，pH 自然，倒平板凝固，涂布0.2 mL 菌液，于28 ℃恒溫培養(yǎng)7d，考察不同添加量的無水乙醇對酵母菌菌落生長狀況的影響。

1.2.3.2 酵母菌ZGJ-4 的抗?jié)B透壓測試

采用液體培養(yǎng)基配方，加入不同量的KCL 使其在培養(yǎng)基中的濃度分別為1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L、2.5 mol/L、3.0 mol/L，pH 自然，裝液量50 mL/250 mL 錐形瓶，接種量為2%，于28 ℃，160 r/min，培養(yǎng)5 d，考察不同滲透壓下酵母菌菌落生長狀況。

1.2.3.3 酵母菌ZGJ-4 的抗饑餓時間測試

采用液體培養(yǎng)基配方，裝液量50 mL/250 mL錐形瓶，接種量為2%，接種菌株均經(jīng)過不同天數(shù)的饑餓處理，在室溫25 ℃條件下饑餓天數(shù)為3 d、5 d、7 d、9 d 和11 d，再置于28 ℃，160 r/min，培養(yǎng)5 d，考察不同饑餓程度對酵母菌菌落生長狀況的影響。

1.2.3.4 酵母菌ZGJ-4 的抗高溫測試

采用斜面培養(yǎng)基，pH 自然，倒平板凝固，涂布0.2 mL 菌液，分別于20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃和40 ℃溫度下恒溫培養(yǎng)7 d，考察高溫對酵母菌菌落生長狀況的影響。

1.2.3.5 酵母菌ZGJ-4 的抗高糖測試

采用液體培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)基中分別按比例5%、10%、15%、20%、25%、30%添加蔗糖，pH自然，裝液量50 mL/250 mL 錐形瓶，接種量為2%。在28 ℃、160 r/min 條件下培養(yǎng)5 d，考察不同含糖量對酵母菌菌落生長狀況的影響。

1.2.3.6 酵母菌ZGJ-4 的抗低pH 測試

采用液體培養(yǎng)基配方，加入磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH，使pH 分別為3.0、4.0、5.0、6.0 和7.0，裝液量50 mL/250 mL 錐形瓶，接種量為2%，在28 ℃，160 r/min 條件下培養(yǎng)5 d，考察不同pH 對酵母菌菌落生長狀況的影響。

1.2.4 酵母菌ZGJ-4 制備海藻糖工藝研究

1.2.4.1 工藝流程

斜面菌種→菌種擴(kuò)培→發(fā)酵培養(yǎng)→收集菌體→饑餓處理→干燥脫水→干燥粉碎→膜過濾→濃縮結(jié)晶

1.2.4.2 操作過程

a） 接種。將含有酵母菌ZGJ-4 的斜面菌苔，刮取2 環(huán)菌體接種到內(nèi)裝10 mL 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，溫度32 ℃、220 r/min 條件下培養(yǎng)2 d。

b） 菌種擴(kuò)培。將培養(yǎng)基中長勢良好的酵母菌ZGJ-4 菌液，接種到盛有100 mL 種子培養(yǎng)基的1 L搖瓶中，發(fā)酵溫度32 ℃，220 r/min 條件下培養(yǎng)2 d。

c） 發(fā)酵培養(yǎng)。將擴(kuò)培好的酵母菌ZGJ-4 菌液，按8%的比例接種到盛有3 L 發(fā)酵培養(yǎng)基的10 L 發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵4 d。

d） 收集菌體，讓菌體饑餓處理3 h，再用離心機(jī)脫水并烘干，用粉碎機(jī)粉碎。

e） 用去離子水溶解，均勻攪拌1 h，再用超濾膜過濾。

f） 濃縮結(jié)晶:將濾液在一定條件下濃縮，得海藻糖產(chǎn)品。

g） 檢測：經(jīng)HPLC 檢測，檢測方法參照文獻(xiàn)[9]、[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)海藻糖酵母菌ZGJ-4 的菌學(xué)特性

經(jīng)培養(yǎng)，菌株在高溫條件下，斜面培養(yǎng)基上生長的菌落呈乳白色（圖1），酵母菌長勢良好。挑取酵母菌單菌體做裝片，在顯微鏡下觀察酵母菌的個體形態(tài)（圖2）。

形態(tài)特征：在斜面培養(yǎng)基上，菌落大小為6 mm～8 mm，正面圓形，側(cè)面為低凸面，邊緣整齊，乳白色，濕潤，較光滑，黏稠，易用接種環(huán)挑取，有微弱的果香味、酸味產(chǎn)生。在液體培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)時，有菌環(huán)，沉淀，菌液混濁，產(chǎn)氣明顯。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞個體呈球形或橢圓形，直徑約為（5.2～12.7） μm。單個或成雙，芽殖。

圖1 斜面菌苔

圖2 個體形態(tài)

生理生化特征：ZGJ-4 與GenBank 上其他酵母菌的18S rRNA 和26S rRNA 核苷酸序列的一致性分別為99%和97%，該菌株屬于釀酒酵母。在碳源的氧化測定中，當(dāng)以D-海藻糖為唯一碳源時，GZJ-4 具有強(qiáng)氧化能力，測定結(jié)果呈陽性，菌株生長能力好，代謝產(chǎn)物積累顯著；當(dāng)以蔗糖、α-D-葡萄糖、麥芽糖、D-棉子糖、龍膽二糖等為唯一碳源時，GZJ-4 氧化能力呈弱陽性，菌株生長能力較弱，代謝產(chǎn)物積累不顯著。在碳源利用上，ZGJ-4 可以有效利用D-海藻糖，其次利用龍膽二糖、麥芽糖、蔗糖、α-D-葡萄糖，不能利用D-蜜二糖、纖維二糖、D-半乳糖和糊精等。

2.2 產(chǎn)海藻糖酵母菌ZGJ-4 的抗性研究

2.2.1 酵母菌ZGJ-4 的抗酒精測試結(jié)果

酵母菌ZGJ-4 的抗酒精測試結(jié)果見表1。

表1 酵母菌ZGJ-4 的抗酒精測試結(jié)果

由表1 可知，當(dāng)酒精添加量逐漸增加時，酵母菌的生長與繁殖受到的抑制程度就越強(qiáng)烈，其菌落表現(xiàn)出的性狀就越不正常。當(dāng)酒精添加量超出2.8 mL，酵母菌生長開始受到限制，酒精含量越高菌種越易出現(xiàn)自溶退化的現(xiàn)象。

2.2.2 酵母菌ZGJ-4 的抗?jié)B透壓測試結(jié)果

酵母菌ZGJ-4 的抗?jié)B透壓測試結(jié)果見表2。

表2 酵母菌ZGJ-4 的抗?jié)B透壓測試結(jié)果

由表2 可知，酵母菌的生長受培養(yǎng)液滲透壓的影響較大；當(dāng)培養(yǎng)液中的KCl 濃度超過2.0 mol/L時，此時培養(yǎng)液的滲透壓已經(jīng)超出了酵母菌所能承受的極限，在此環(huán)境下酵母菌無法進(jìn)行正常生長與繁殖，所以培養(yǎng)液中酵母菌體含量很低，培養(yǎng)液呈現(xiàn)清亮透明狀。

2.2.3 酵母菌ZGJ-4 的抗饑餓測試結(jié)果

酵母菌ZGJ-4 的抗饑餓測試結(jié)果見表3。

表3 酵母菌ZGJ-4 的抗饑餓測試結(jié)果

由表3 可知，饑餓7 d 內(nèi)對酵母菌的正常生長、繁殖影響不大。當(dāng)酵母菌由饑餓環(huán)境轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中時很快就可以進(jìn)行正常的生長繁殖。由此可知，當(dāng)酵母菌饑餓時有可能進(jìn)入了休眠狀態(tài)，以芽孢的形態(tài)幫助度過饑餓時間，當(dāng)酵母菌被接種到新鮮的培養(yǎng)基中時很快就從休眠狀態(tài)蘇醒進(jìn)行正常的生長繁殖。

2.2.4 酵母菌ZGJ-4 的抗高溫測試結(jié)果

普通酵母菌的最適生長溫度為26 ℃～28 ℃，耐受溫度為38 ℃，高溫會大大抑制酵母菌的生長，一般情況下當(dāng)溫度達(dá)到一定程度時酵母菌的生長會受到強(qiáng)烈抑制甚至停止生長，就算有所生長所表達(dá)出來的性狀也很糟糕，這個溫度即酵母菌的耐受極限溫度。

酵母菌ZGJ-4 的抗高溫測試結(jié)果見表4。

表4 酵母菌ZGJ-4 的抗高溫測試結(jié)果

由表4 可知，酵母菌ZGJ-4 在28 ℃～32 ℃下生長良好，且在40 ℃高溫條件下，該菌仍能生長，其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理特征等未發(fā)生變化，研究表明酵母菌ZGJ-4 具有一定的抗高溫能力。

2.2.5 酵母菌ZGJ-4 的抗高糖測試結(jié)果

酵母菌ZGJ-4 的抗高糖測試結(jié)果見表5。

表5 酵母菌ZGJ-4 的抗高糖測試結(jié)果

由表5 可知，培養(yǎng)基中含糖量對酵母菌的生長繁殖無明顯影響，可能是因為在接種后一段時間內(nèi)酵母菌進(jìn)行生長繁殖消耗了大量糖分，而維持菌體生長繁殖代謝則需要不斷補(bǔ)充蔗糖等碳源物質(zhì)的供給。

2.2.6 酵母菌ZGJ-4 的抗低pH 測試結(jié)果

酵母菌ZGJ-4 的抗低pH 測試結(jié)果見表6。

表6 酵母菌ZGJ-4 的抗低pH 測試結(jié)果

由表6 可知，酵母菌在pH 為3.0～7.0 這個范圍內(nèi)，具有較好的生長狀況，但是在pH 為3.0～5.0時，酵母菌具有較強(qiáng)的生長和繁殖能力，所以對應(yīng)的培養(yǎng)液內(nèi)其渾濁程度最高，在這幾組試驗中，當(dāng)pH 為4.0 時，酵母菌的代謝是最活躍的，所以此條件下產(chǎn)生的發(fā)酵液具有濃郁酒香味。

2.3 酵母菌ZGJ-4 發(fā)酵制備海藻糖的試驗結(jié)果

8%酵母懸液→過80 目篩2 次→加5%酒石酸，沉降30 min→4 ℃，3 600 r/min 離心10 min→棄去上清液→HPLC 檢測。檢測結(jié)果為：每100 g 干重細(xì)胞含有35 g 海藻糖，海藻糖得率＞80%。

3 結(jié)論

綜上所述，酵母菌ZGJ-4 在高溫、高糖、低pH 和饑餓等條件下均能正常生長，未發(fā)生菌株形態(tài)變異、菌株性能退化等現(xiàn)象，說明酵母菌ZGJ-4具備抗高溫、抗饑餓等顯著性特征，所以酵母菌ZGJ-4 可用來制備海藻糖。同時，由于ZGJ-4 來自汁液偏酸（pH4.5） 的皺皮柑，對高酸性環(huán)境有很強(qiáng)忍耐力，因此還可應(yīng)用于果汁尤其是高酸性果汁如山葡萄汁、獼猴桃汁和山楂汁等的發(fā)酵，酵母菌ZGJ-4 有很大的開發(fā)前景。