純化學合成緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基的研制*

張國勇 曲 萍 鄧自新* 董培智 崔生輝

（1山西省食品藥品檢驗所，山西太原 030031）

（2中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基（BPW） 是一種非選擇性增菌培養(yǎng)基，可用于沙門氏菌預增菌培養(yǎng)。該培養(yǎng)基配方中添加蛋白胨為微生物提供碳源與氮源，其他無機鹽維持培養(yǎng)基滲透壓。國內外對緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基的研究主要比較不同廠家培養(yǎng)基對沙門氏菌預增菌效果的影響，以及在此基礎上進行的沙門氏菌預增菌試驗。Han 利用吸光度和平板計數(shù)法比較8 種廠家培養(yǎng)基對沙門氏菌預增菌效果的影響；

Weng 等以緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基為基礎，加入適合濃度的促進劑、抑制劑以及營養(yǎng)物質制成共增菌培養(yǎng)基SSSV；Gao 利用50 株菌評價即用型緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基的靈敏度和特異性。Beckers P 比較了緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基和TBB 培養(yǎng)基在檢測沙門氏菌及腸桿菌中的預增菌效果。目前，緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基（BPW） 用到的蛋白胨、牛肉膏、酵母粉等復雜成分，來源不明，加工工藝混亂，缺乏統(tǒng)一的質量控制標準，導致成品的批間差異較大，可變因素多，質量難以控制，且存在引入外源性病毒的安全隱患，進而影響試驗結果的準確性。因此，研制由分子結構清晰、可溯源的純化學合成食品微生物參比培養(yǎng)基，構建客觀、準確、可操作性強的培養(yǎng)基評價體系，勢在必行。

純化學合成培養(yǎng)基（Chemically Defined Culture Medium） 由已知分子結構和純度的化學成分配制而成。純化學合成培養(yǎng)基用化學成分替代了天然成分，質量穩(wěn)定可靠。目前，純化學合成培養(yǎng)基已廣泛用于提高發(fā)酵產物的產量，I.A.El-Kady 等用純化學培養(yǎng)基發(fā)酵葡萄穗霉使維魯卡林J 產量提高到11.8 mg/L；Hyun-Koo Nam 等將甘油加入到含氨基酸的純化學合成培養(yǎng)基中，發(fā)酵重組基因的大腸桿菌DH5a，提高了β-胡蘿卜素產量。純化學合成培養(yǎng)基亦可增加細菌生長量，Angela Restrepo 等探究純化學合成培養(yǎng)基對巴西副球菌生長量的影響；Kadri Aller 等配制純化學培養(yǎng)基培養(yǎng)乳糖乳桿菌IL1403，結果表明谷氨酰胺、天冬氨酸有利于乳糖乳桿菌的生長，同時支鏈氨基酸可以提高細菌生長率；Yu Chen 等開發(fā)優(yōu)化了可促進凝結芽胞桿菌高密度生長的純化學合成培養(yǎng)基；VartanovaNO 等合成一種新布魯氏菌培養(yǎng)基培養(yǎng)幽門螺旋桿菌，除加入血紅蛋白外，培養(yǎng)基中還加入鐵離子、谷氨酰胺保證幽門螺旋桿菌生長。還有關于細菌快速檢測純化學合成培養(yǎng)基的報道，F(xiàn)eng 等根據(jù)大腸桿菌發(fā)酵乳酸產酸產氣的特性開發(fā)了純化學合成培養(yǎng)基，用于快速檢測大腸桿菌。

根據(jù)國標GB 4789.28—2013《食品安全國家標準食品微生物學檢驗培養(yǎng)基和試劑》的質量要求，緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基的質控菌株為鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 菌株。采用非選擇性分離和計數(shù)固體培養(yǎng)基的目標菌生長率定量測試方法，在鹽溶液的基礎上，添加多種氨基酸、維生素、無機鹽多次重復篩選出可以促進鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 生長的物質，合成新的純化學緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗菌株：鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium，ATCC14028），-80 ℃冰箱保藏，由中國食品藥品檢定研究院提供。

培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂、MH 培養(yǎng)基、腦心浸出液培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物公司；營養(yǎng)肉湯，北京三藥科技公司；緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基，美國BD 公司。

試劑：氨基酸、維生素、無機鹽等，Sigma 公司。葡萄糖鹽溶液：葡萄糖4.0 g/L、磷酸氫二鈉6.78 g/L、磷酸二氫鉀3.0 g/L、氯化鈉0.5 g/L、氯化銨1.0 g/L。

儀器：法國梅里埃高智能全自動微生物分析系統(tǒng)VITEK2；Thermo 全波長酶標儀Multiskan GO 等。

1.2 菌懸液制備

將鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 在腦心浸出液培養(yǎng)基中活化，36 ℃培養(yǎng)過夜，取新鮮過夜菌液涂布于MH 瓊脂培養(yǎng)基，36 ℃過夜培養(yǎng)，取MH 平板上培養(yǎng)過夜的二代沙門氏菌新鮮培養(yǎng)物，用棉簽刮取至無菌生理鹽水中，調制McFarland 值為1.0 左右的菌懸液，用無菌水稀釋1 000 倍，備用。

1.3 細菌OD600 值的測定

將細菌36 ℃培養(yǎng)4 h、24 h、48 h 后，將96 孔板培養(yǎng)物置于混懸儀懸1 min～2 min，反復顛倒混勻待其膜上無水汽，迅速置于酶標儀測量600 nm波長處的吸光度值。

1.4 單個成分篩選

用葡萄糖鹽溶液作溶劑，將每種單一成分配制成高中低3 種不同質量濃度的溶液，具體見下頁表1。在96 孔板中按比例逐一添加各種溶液，每種物質設置3 種濃度梯度，每個濃度重復3 個孔，再加入上述菌懸液使得最終濃度達到103CFU～104CFU，用96 孔板封膜封板，36 ℃培養(yǎng)。

1.5 7 種物質基礎上篩選

在7 種有效成分（甲硫氨酸、維生素C、胱氨酸二鹽酸鹽、半胱氨酸、硫酸腺嘌呤、硫酸鎂、硫酸錳） 的混合液基礎上逐一添加其余39 種成分進行第二輪篩選。用葡萄糖鹽溶液作溶劑，將篩選的7 種成分按最適濃度混合，配制成混合液，在此基礎上添加39 種物質，每個物質設置3 個濃度，每個濃度重復3 個孔，每孔中加入適量菌懸液使得最終濃度達到103 CFU～104 CFU，用96 孔板封膜封板，36 ℃培養(yǎng)。

表1 單個成分及其質量濃度

1.6 8 種物質中有效成分篩選

篩選出8 種成分（甲硫氨酸、維生素C、胱氨酸二鹽酸鹽、半胱氨酸、硫酸腺嘌呤、硫酸鎂、黃嘌呤、硫酸錳） 進行最適物質篩選。分別用葡萄糖鹽溶液做溶劑，配制溶液方法如表2 所示。

表2 混合物質配制方法

1.7 自制純化學培養(yǎng)基與市售培養(yǎng)基比較

根據(jù)之前試驗結果，按照配方（葡萄糖4 g/L、硫酸鎂0.05 g/L、磷酸氫二鈉6.78 g/L、磷酸二氫鉀3.0 g/L、氯化鈉0.5 g/L、氯化銨1.0 g/L） 制成純化學合成緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基，與市售BPW 培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯做對比，在96 孔板中按比例逐一添加各種溶液，每種物質設置3 種濃度梯度，每個濃度重復3 個孔，每孔中加入適量菌懸液，使得最終濃度達到103CFU～104CFU，用96 孔板封膜封板，36 ℃培養(yǎng)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0 軟件單因素方差中的LSD 多重比較法，使用Excel 2010 和GraphPad 7.0分析數(shù)據(jù)及制表繪圖。

2 結果與分析

2.1 單個成分篩選結果

葡萄糖鹽溶液作為對照組，添加氨基酸、維生素以及無機鹽等46 種成分分別配制成高中低不同質量濃度溶液，逐一篩選出對鼠傷寒沙門氏菌有促生長作用的7 種物質，且7 種物質質量濃度與促生長能力相關。7 種物質對細菌生長影響結果如圖1所示。由圖1 可知，硫酸鎂、胱氨酸二鹽酸鹽高濃度與中濃度、低濃度在促進細菌生長方面存在差異（P<0.05），兩者中濃度與低濃度無差異，且低濃度硫酸鎂、胱氨酸二鹽酸鹽效果好；維生素C 中濃度與高、低濃度在促進細菌生長方面存在差異（P<0.05），故中濃度維生素C 效果好；硫酸錳高濃度與中濃度在細菌生長方面存在差異（P<0.05），低濃度與高、中濃度無差異，選用低濃度硫酸錳；甲硫氨酸、半胱氨酸、硫酸腺嘌呤的高中低3 種濃度均無差異，故低濃度較宜。

圖1 7 種有效成分不同濃度對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028生長影響

最適濃度的7 種物質對沙門氏菌促生長能力比較結果如圖2 所示。由圖2 可知，與對照組相比，7 種物質對細菌促生長能力存在差異（P<0.05）；其中低濃度硫酸鎂與對照組存在顯著性差異（P<0.01）；分析得知，低濃度硫酸鎂對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 生長影響較大；其余6 種物質甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸二鹽酸鹽、維生素C、硫酸腺嘌呤、硫酸錳均促進細菌生長，但影響較弱。

圖2 最適濃度的7 種有效成分對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 生長影響

7 種最適濃度物質對鼠傷寒沙門氏菌生長影響如圖3 所示。由圖3 可知，培養(yǎng)4 h 后，7 種物質均無明顯生長，培養(yǎng)24 h 時硫酸鎂培養(yǎng)的細菌OD600值達到0.35，甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、硫酸腺嘌呤、硫酸錳培養(yǎng)的細菌OD600值達到0.18，維生素C 培養(yǎng)的細菌生長緩慢，48 h 后OD600值才達到0.15，培養(yǎng)48 h 后甲硫氨酸培養(yǎng)的細菌開始進入衰亡期，其余6 種物質培養(yǎng)的細菌均有所增長，且生長緩慢。

圖3 最適濃度的多種有效成分對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 生長曲線

2.2 7 種物質基礎上的篩選結果

為了探究2 種或者多種物質聯(lián)合是否會促進鼠傷寒沙門氏菌的生長，在46 種物質篩選的7 種有效成分（甲硫氨酸、維生素C、胱氨酸二鹽酸鹽、半胱氨酸、硫酸腺嘌呤、硫酸鎂、硫酸錳） 混合液基礎上逐一添加39 種成分進行第二輪篩選。通過試驗在7 種有效成分的基礎上篩選出促進鼠傷寒沙門氏菌生長的有效成分黃嘌呤，不同質量濃度黃嘌呤的添加對鼠傷寒沙門氏菌生長的影響結果如圖4所示。由圖4 可知，7 種物質均存在作為對照組時，細菌OD600值（0.2～0.23） 較僅有硫酸鎂時細菌OD600值（0.35） 的情況下較低，當加入黃嘌呤時細菌OD600值均可達0.25 左右，組內方差分析表明，高濃度與中、低濃度存在差異（P<0.05），其中高濃度黃嘌呤培養(yǎng)的細菌OD600值可達0.3。結果分析表明，7 種物質存在的條件下，黃嘌呤可以促進細菌生長，且高濃度黃嘌呤效果較好。

圖4 不同濃度的黃嘌呤對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 生長影響

高濃度黃嘌呤對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028生長曲線如圖5 所示。由圖5 可知，當培養(yǎng)4 h 后，加有黃嘌呤溶液與對照組在細菌濁度無明顯差別，24 h 時黃嘌呤培養(yǎng)的細菌OD600值已達到0.3，對照組7 種物質培養(yǎng)的細菌OD600值達到0.2，兩者存在差異（P<0.05）；48h 試驗組OD600值有所上升；7種物質OD600值稍有下降。試驗表明：培養(yǎng)48 h 后，7 種混合物質存在的情況下，高濃度黃嘌呤可以促進鼠傷寒沙門氏菌生長。

圖5 高濃度黃嘌呤對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 生長曲線

2.3 8 種物質中有效成分篩選結果

在7 種物質基礎上從39 種物質中篩選出可以促進沙門氏菌生長的黃嘌呤，結合以上結果，在促鼠傷寒沙門氏菌生長的8 種物質（甲硫氨酸、維生素C、胱氨酸二鹽酸鹽、半胱氨酸、硫酸腺嘌呤、硫酸鎂、硫酸錳、黃嘌呤） 中，硫酸鎂促進效果最佳，黃嘌呤在多種物質基礎上發(fā)揮作用，故將硫酸鎂、黃嘌呤與其余6 種物質配制成6 組混合溶液進行試驗，探究硫酸鎂、黃嘌呤、6 種物質的促生長作用。

進一步探究硫酸鎂、黃嘌呤、6 種物質（甲硫氨酸、維生素C、胱氨酸二鹽酸鹽、半胱氨酸、硫酸腺嘌呤、硫酸錳） 中有效成分，配制溶液1（硫酸鎂）、溶液2（硫酸鎂+6 種物質）、溶液3（6 種物質）、溶液4（8 種物質）、溶液5（黃嘌呤）、溶液6（黃嘌呤+6 種物質） 進行試驗，結果如圖6 所示。

圖6 不同混合溶液對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 生長影響

由圖6 可知，與對照組相比，溶液2 培養(yǎng)的細菌OD600值存在差異（P<0.05）；與對照組相比，溶液1、溶液4 培養(yǎng)的細菌OD600值存在顯著性差異（P<0.01）；溶液1、溶液4 以及溶液2 試驗結果表明，硫酸鎂單獨存在時，促進細菌生長的效果最佳；八種物質也可促進細菌生長，效果次之；硫酸鎂和6 種物質存在時，效果一般；進一步分析得出，硫酸鎂存在時，細菌生長良好，缺乏硫酸鎂時，細菌生長不佳，可見硫酸鎂能有效促進細菌生長。

硫酸鎂、黃嘌呤、6 種物質（甲硫氨酸、維生素C、胱氨酸二鹽酸鹽、半胱氨酸、硫酸腺嘌呤、硫酸錳） 配制的6 種混合溶液對鼠傷寒沙門氏菌的生長影響結果如圖7 所示。

圖7 有效成分對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 生長曲線

由圖7 可知，當培養(yǎng)4 h 時，各種物質均生長且無明顯差異；培養(yǎng)至24 h 時溶液1 細菌OD600值達0.35，溶液4 培養(yǎng)的細菌OD600值達0.3，溶液2培養(yǎng)的細菌OD600值達0.18；48 h 時細菌OD600值均有所上升。試驗表明，硫酸鎂在鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 生長過程中起到關鍵作用，硫酸鎂在BPW 培養(yǎng)基中必不可少。

2.4 自制純化學培養(yǎng)基與市售培養(yǎng)基對比

根據(jù)GB4789.28 中蛋白胨水培養(yǎng)基的標準要求進行研制，將50 mg/L 硫酸鎂加入鹽溶液中制成純化學合成培養(yǎng)基S-BPW 1（硫酸鎂）、S-BPW 2（七水硫酸鎂），與市售培養(yǎng)基緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基（BPW）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB） 進行對比試驗，葡萄糖鹽溶液作為對照組，結果如圖8 所示。

圖8 自制純化學培養(yǎng)基與市售培養(yǎng)基對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 生長影響比較

由圖8 可知，S-BPW 1 和S-BPW 2 培養(yǎng)的細菌OD600 值均高于市售緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基（BPW）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB），2 組自制培養(yǎng)基與市售緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基存在差異（P<0.05），自制純化學合成緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基在促進細菌生長方面已達到市售緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基效果。

純化學合成緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基與市售培養(yǎng)基對比生長曲線如圖9 所示。由圖9 可知，培養(yǎng)4 h時各培養(yǎng)基無生長，培養(yǎng)24 h 后，市售緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基（BPW）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）、自制純化學培養(yǎng)基（S-BPW-1、S-BPW-2） 中細菌OD600值均達到0.35，48h 后市售緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基（BPW）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）、自制純化學培養(yǎng)基（S-BPW-1、S-BPW-2） 細菌OD600值均有所上升。結果表明，培養(yǎng)48 h 后自制純化學培養(yǎng)基符合國標緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基（BPW） 標準。

圖9 自制純化學培養(yǎng)基與市售培養(yǎng)基對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 生長曲線比較

無水硫酸鎂與七水硫酸鎂在細菌生長方面的差異如圖10 所示。

圖10 不同形式硫酸鎂對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 生長影響

溶液1（硫酸鎂） 與溶液7（七水硫酸鎂）、溶液2（硫酸鎂和6 種物質） 與溶液8（七水合硫酸鎂和6 種物質） 培養(yǎng)的細菌OD600值無差異（P>0.05），溶液4（硫酸鎂配制的八種混合物質）與溶液9（七水合硫酸鎂配制的八種混合物質） 培養(yǎng)的細菌OD600值存在差異（P<0.05），硫酸鎂單獨培養(yǎng)的細菌OD600值最高，表明硫酸鎂與七水合硫酸鎂在細菌生長方面無差異。培養(yǎng)至24 h，兩者培養(yǎng)的細菌OD600值達0.35，無明顯差異；硫酸鎂是否與水結合均對細菌生長無影響。試驗中發(fā)現(xiàn)其他成分與硫酸鎂混合后會影響細菌生長，6 種物質中哪種成分會降低硫酸鎂對細菌生長影響還有待研究。

3 討論與結論

本試驗在純化學培養(yǎng)基鹽溶液的基礎上添加氨基酸、維生素和無機鹽，篩選出對沙門氏菌有促生長作用的有效成分，制成緩沖蛋白胨水（BPW） 純化學合成培養(yǎng)基。成分：葡萄糖4 g/L、硫酸鎂0.05 g/L、磷酸氫二鈉6.78 g/L、磷酸二氫鉀3.0 g/L、氯化鈉0.5 g/L、氯化銨1.0 g/L，pH7.2±0.2。該培養(yǎng)基能提供沙門氏菌生長所需要的營養(yǎng)物質，培養(yǎng)24 h 的促生長能力與市售緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基相當，且其成分精確，具有良好的可溯源性、穩(wěn)定性和可重復性，質量可控，可以作為參比培養(yǎng)基，為我國BPW 培養(yǎng)基的生產與檢定提供參考價值。

本試驗前期研究發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸二鹽酸鹽、硫酸腺嘌呤、維生素C、硫酸錳6 種物質單獨存在均可有效促進鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 生長，OD600值均可達到0.15～0.2，進一步篩選，在6 種物質和硫酸鎂共同存在時，OD600值達到0.2，加入高濃度黃嘌呤后OD600值均可達到0.3。同樣Mickelson 提出無乳鏈球菌在純化學合成培養(yǎng)基生長離不開胱氨酸；C.Hong 用多種氨基酸制成純化學合成培養(yǎng)基研究嗜熱鏈球菌T1C2 不同生長階段氨基酸消耗量以及必需量，表明半胱氨酸是嗜熱鏈球菌T1C2 生長的必需氨基酸，占總需量的11%，半胱氨酸亦可促進鼠傷寒沙門氏菌生長。當黃嘌呤加入6 種物質和七水硫酸鎂溶液中，對鼠傷寒沙門氏菌生長明顯，與單獨加入硫酸鎂的培養(yǎng)基相當。Meng 指出細菌體內黃嘌呤經黃嘌呤脫氫酶催化最終生成尿酸，此過程可能與菌體生長的不同階段有關。不同的細菌對不同物質敏感度存在差異，除硫酸鎂以外，甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸二鹽酸鹽、硫酸腺嘌呤、維生素C、硫酸錳6 種物質均對鼠傷寒沙門氏菌的生長有不同程度促進作用。

值得注意的是，本試驗中硫酸鎂單獨培養(yǎng)細菌時，OD600值為0.35，表明硫酸鎂在細菌生長中起到關鍵作用。Rui 等利用微量呼吸測壓法等技術探究硫酸鎂對損傷菌修復的影響，發(fā)現(xiàn)硫酸鎂對大腸桿菌，特別是損傷大腸桿菌有促進修復的作用。硫酸鎂對不同細菌生長亦有促進作用，Tesh M J 發(fā)現(xiàn)七水硫酸鎂在化學合成培養(yǎng)基中促進嗜肺軍團菌生長，濃度在80 μmol/L 時效果最佳，同時也需要氯化鉀的參與。硫酸鎂對細菌生長具有較大影響，尤其在培養(yǎng)含氮物質及氨基酸缺乏時，細菌生長對硫酸鎂的需求增加，且革蘭氏陽性菌對硫酸鎂需求較大。相關報道也指出硫酸鎂是三磷酸腺苷（ATP）參與線粒體反應的輔助因子；鎂離子是除鉀離子外細胞含量最多的陽離子，鎂離子會影響細胞膜離子通道；硫酸鎂還參與其他酶活反應。

本試驗用96 孔細胞培養(yǎng)基板進行細菌培養(yǎng)，培養(yǎng)基容量較小，篩選出的有效物質合成純化學合成培養(yǎng)基后進行擴大體系試驗，結果不佳，查閱相關文獻，推測可能是新合成的純化學培養(yǎng)基中關鍵物質對擴大體系敏感，相關問題有待進一步解決。本試驗研究純化學合成培養(yǎng)基配方，探尋檢出沙門氏菌以及探究沙門氏菌最低生長限度的營養(yǎng)成分，可為我國食品安全抽檢承檢機構微生物檢驗工作提供參考。