產(chǎn)細(xì)菌素菌株A32 食品級(jí)培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件的優(yōu)化*

賈麗艷 暢盼盼 張 麗 蘇芳翠 郝 林 馬淑英

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801）

（2山西省白酒生物工程研究所教育創(chuàng)新中心，山西太谷 030801）

（3蒙牛乳業(yè)太原有限公司，山西太原 030000）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） 廣泛存在于自然界中，不產(chǎn)毒素和熱致敏蛋白，被歸為食品級(jí)微生物范疇?？莶菅挎邨U菌A32（簡(jiǎn)稱(chēng)菌株A32）是從山西老陳醋醋醅中篩選出的一株能產(chǎn)廣譜抑菌素的菌株。菌株A32 可以產(chǎn)抑菌物質(zhì)H2O2 和細(xì)菌素，其發(fā)酵液經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理后的抑菌能力反映了菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素的能力。由于菌株A32 來(lái)源明確、食用安全，具有開(kāi)發(fā)成益生菌微生態(tài)制劑并應(yīng)用于食品領(lǐng)域的潛能。

通過(guò)選擇來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉的食品級(jí)碳源和氮源，開(kāi)發(fā)一種安全且高產(chǎn)細(xì)菌素的食品級(jí)培養(yǎng)基，對(duì)進(jìn)一步提高菌株A32 及其所產(chǎn)細(xì)菌素在食品中的應(yīng)用，降低其生產(chǎn)成本，具有重要意義。本研究以食品級(jí)原料為發(fā)酵底物，通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選出最適的碳源、氮源，確定最佳的料液比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵初始pH、搖床轉(zhuǎn)速；利用PB 試驗(yàn)篩選出關(guān)鍵的影響因子；采用響應(yīng)面法對(duì)篩選出的關(guān)鍵因子進(jìn)行優(yōu)化，從而獲得高產(chǎn)細(xì)菌素A32 的最佳發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株A32，分離自山西老陳醋醋醅，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

指示菌，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程生物工程學(xué)院保藏。

1.2 試劑

過(guò)氧化氫酶（5 000 U/mg），北京索寶來(lái)科技有限公司；蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、氯化鈉、胰蛋白胨等為常規(guī)試劑。

高粱粉、土豆粉、小米、綠豆粉、豌豆、黑豆等，均購(gòu)自山西太谷縣家家利超市。

1.3 主要儀器及設(shè)備

YS04A 小型高速粉碎機(jī)，北京燕山正德機(jī)械有限公司；GZX-GF101-3-BS-Ⅱ/H 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；ZWY-1102C恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；DHP-500S 型電熱培養(yǎng)箱，北京市光明醫(yī)療儀器廠(chǎng)；牛津杯，上海兢翀電子科技發(fā)展有限公司；Thermo Scientific 移液器，賽默飛世爾（上海） 儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸膏0.5 g、胰蛋白胨1.0 g、NaCl 1.0 g、蒸餾水100 mL，pH 7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏0.5 g、蛋白胨1.0 g、NaCl 0.5 g、瓊脂粉2.0 g,蒸餾水100 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.4.2 菌株A32 的活化和培養(yǎng)

將菌株A32 接種于牛肉膏培養(yǎng)基中活化，30℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h。按照4%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min 的條件下振蕩培養(yǎng)36 h。

1.4.3 菌株A32 發(fā)酵液及其所產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌性試驗(yàn)

將過(guò)氧化氫酶溶解于枯草芽孢桿菌上發(fā)酵清液中，使過(guò)氧化氫酶終濃度達(dá)到5 μg/mL，30 ℃，溫浴2 h。取200 μL 過(guò)氧化氫酶處理前后的發(fā)酵液做牛津杯抑菌試驗(yàn)，測(cè)定其抑菌圈直徑大小。每組做3 個(gè)平行。

1.4.4 培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.4.4.1 碳源的篩選

分別稱(chēng)取15 g 高粱粉、小米粉、土豆粉代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源酵母膏，加水1 000 mL，胰蛋白胨和氯化鈉添加量保持不變，以發(fā)酵培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基組作為對(duì)照組，將菌株A32 以4%接種量接入培養(yǎng)基中，30 ℃、130 r/min 培養(yǎng)36 h，5 000 r/m離心15 min～20 min，做菌株A32 發(fā)酵液及其所產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌性試驗(yàn)，確定最佳碳源。每組做3 個(gè)平行。

1.4.4.2 氮源的篩選

在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以篩選出的最佳碳源為基礎(chǔ)，分別稱(chēng)取10 g 綠豆粉、豌豆粉和黑豆粉代替胰蛋白胨作為氮源，加水1 000 mL，氯化鈉的添加量保持不變，以不加氮源組為空白對(duì)照。將菌株A32 以4%的接種量接入培養(yǎng)基中，30 ℃，130 r/min 培養(yǎng)36 h，做菌株A32 發(fā)酵液的抑菌試驗(yàn)，確定最佳氮源。每組做3 個(gè)平行。

1.4.4.3 料液比的篩選

在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，選用試驗(yàn)篩選出的最佳碳氮源取代酵母膏和胰蛋白胨，保持水添加量不變，逐倍增加碳源和氮源的添加量，使其料液比分別為：1∶40，1∶20，3∶40，1∶10，1∶8，制備成培養(yǎng)基。將菌株A32 以4%接種量接入培養(yǎng)基中，30 ℃，130 r/min 培養(yǎng)36 h，做菌株A32 發(fā)酵液的抑菌試驗(yàn)，確定最佳料液比。每組做3 個(gè)平行。

1.4.4.4 起始pH 值的篩選

以最佳料液比為基礎(chǔ)，設(shè)置起始pH 分別為4、5、6、7、8，制備成培養(yǎng)基。將菌株A32 以4%接種量接入培養(yǎng)基中，30 ℃，130 r/min 培養(yǎng)36 h，做菌株A32 發(fā)酵液的抑菌試驗(yàn)，確定最佳起始pH值。每組做3 個(gè)平行。

1.4.4.5 發(fā)酵時(shí)間的確定

以篩選出的最佳起始pH 值和最佳料液比為基礎(chǔ)，制備成無(wú)菌培養(yǎng)基。將菌株A32 以4%接種量接入培養(yǎng)基中，30 ℃，130 r/min 分別培養(yǎng)24 h、48 h、36 h、60 h、72 h，做菌株A32 發(fā)酵液的抑菌試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。每組做3 個(gè)平行。

1.4.4.6 搖床轉(zhuǎn)速的確定

以篩選出的最佳起始pH 值、最佳料液比、最佳發(fā)酵時(shí)間為基礎(chǔ)，在0 r/min、130 r/min、140 r/min、150 r/min、160 r/min、170 r/min 的轉(zhuǎn)速下，30 ℃培養(yǎng)36 h，做菌株A32 發(fā)酵液的抑菌試驗(yàn)，確定最佳搖床轉(zhuǎn)速。每組做3 個(gè)平行。

1.4.5 PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)碳氮源及發(fā)酵條件的篩選結(jié)果，菌株A32的發(fā)酵培養(yǎng)基影響因素包括高粱粉添加量、綠豆粉添加量、料液比、培養(yǎng)基起始pH 值、發(fā)酵時(shí)間及搖床轉(zhuǎn)速，對(duì)以上幾個(gè)因素進(jìn)行PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 因子篩選試驗(yàn)因素水平表

1.4.6 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)PB 試驗(yàn)結(jié)果，篩選出對(duì)S.aureus 抑菌活性顯著的影響因素，結(jié)合因素的效應(yīng)大小和試驗(yàn)中的實(shí)際情況，以抑菌圈直徑大小為響應(yīng)值設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)（表2），得出其最佳的培養(yǎng)及發(fā)酵條件。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素的影響

以食品級(jí)碳源代替發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源培養(yǎng)菌株A32 并檢測(cè)其發(fā)酵液的抑菌性，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可知，以高粱粉為碳源的菌株A32 發(fā)酵液對(duì)S.aureus 的抑菌圈直徑為（27.0±0.63） mm，過(guò)氧化氫酶處理后的菌株A32 發(fā)酵液的抑菌圈直徑為（22.3±0.29） mm，表明以高粱粉為碳源的菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素的能力最強(qiáng)。造成以上現(xiàn)象的原因可能是：①與菌株A32 的來(lái)源有關(guān)。菌株A32 分離自以高粱為主要原料的新鮮醋醅，菌株在長(zhǎng)期馴化過(guò)程中對(duì)高粱適應(yīng)性更強(qiáng)、利用率更高。②與高粱粉營(yíng)養(yǎng)成分比較豐富有關(guān)。高粱除含淀粉65.9%～77.4%，蛋白質(zhì)8.4%～14.5%，粗脂2.4%～10.4%外，還含有豐富的氨基酸、維生素及礦物元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠滿(mǎn)足菌株所需的營(yíng)養(yǎng)需求。此外，由于高粱粉來(lái)源廣泛，成本低廉，因此選擇高粱粉作為菌株A32 的碳源。

2.2 氮源對(duì)菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素的影響

圖1 碳源對(duì)菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響

氮源是菌體生長(zhǎng)必不可少的原料，對(duì)菌體的生長(zhǎng)和代謝具有重要意義。氮源對(duì)菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2 可知，添加氮源后發(fā)酵液的抑菌效果均明顯高于未添加氮源組，且綠豆粉作為氮源，其發(fā)酵液的抑菌效果強(qiáng)于其他對(duì)照組。以綠豆粉為氮源的菌株A32 發(fā)酵液對(duì)S.aureus 的抑菌圈直徑為（21.3±0.29） mm；過(guò)氧化氫酶處理后的菌株A32 發(fā)酵液抑菌圈直徑為（16.4±0.85） mm，表明當(dāng)?shù)礊榫G豆粉時(shí)，菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素的能力最強(qiáng)。此外，綠豆粉來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉，因此選擇綠豆粉作為菌株A32 食品級(jí)培養(yǎng)基的氮源。

圖2 氮源對(duì)菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響

2.3 料液比對(duì)菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素的影響

料液比對(duì)菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3 可知，隨著料液比的增大，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度增加，菌體的營(yíng)養(yǎng)條件豐富，生長(zhǎng)代謝旺盛，產(chǎn)抑菌物質(zhì)的能力增強(qiáng)。當(dāng)料液比為3:40 時(shí)，發(fā)酵液的抑菌效果達(dá)到最優(yōu)。未經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理的菌株A32 發(fā)酵液對(duì)S.aureus 的抑菌圈直徑為（25.6±1.15） mm，過(guò)氧化氫酶處理后，菌株A32 發(fā)酵液對(duì)S.aureus 的抑菌圈直徑為（22.0±0.30） mm，表明當(dāng)料液比為3:40 時(shí)，菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素的能力最強(qiáng)。

圖3 料液比對(duì)菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響

2.4 起始pH 值對(duì)菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素的影響

pH 是影響微生物繁殖及代謝的重要外界因子，同時(shí)調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程中各種代謝產(chǎn)物及酶活，不同的pH 值通過(guò)影響菌體的代謝過(guò)程，改變產(chǎn)物的產(chǎn)量及質(zhì)量，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4 可知，當(dāng)起始pH值為6.0 時(shí)，菌株A32 發(fā)酵液對(duì)S.aureus 的抑菌圈直徑達(dá)到最大。未經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理的發(fā)酵液對(duì)S.aureus 的抑菌圈為（25.8±0.66） mm，處理后的抑菌圈為（23.2±0.53） mm，結(jié)果表明起始pH 值為6.0 時(shí)，菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素的能力最強(qiáng)。

圖4 起始pH 對(duì)菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響

2.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5 可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到60 h 時(shí)，發(fā)酵液對(duì)S.aureus 的抑菌效果均達(dá)到最大。過(guò)氧化氫酶處理前菌株A32 發(fā)酵液對(duì)S.aureus 的抑菌圈直徑為（29.2±2.21） mm；過(guò)氧化氫酶處理后，菌株A32 發(fā)酵液對(duì)S.aureus 的抑菌圈直徑為（25.4±0.65） mm，表明發(fā)酵時(shí)間為60 h 時(shí)，菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素的能力最強(qiáng)。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響

2.6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素的影響

菌株A32 屬于好氧型微生物，其繁殖代謝需要氧氣的參與。在發(fā)酵液和水中氧氣的溶解度較小，需要通過(guò)不斷的通風(fēng)和攪拌，使氧氣充分進(jìn)入發(fā)酵液中，促進(jìn)微生物的代謝及繁殖。溶氧的多少也會(huì)影響菌體生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物含量及質(zhì)量。同時(shí)，充足的氧氣雖然有利于菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成，但當(dāng)氧氣含量過(guò)高時(shí)反而會(huì)抑制產(chǎn)物的形成。本試驗(yàn)通過(guò)調(diào)整搖床轉(zhuǎn)速來(lái)控制發(fā)酵液溶氧量，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響

由圖6 可知，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速達(dá)到140 r/min 時(shí)，菌株A32 發(fā)酵液對(duì)S.aureus 的抑制圈直徑達(dá)到最大。過(guò)氧化氫酶處理前，菌株A32 發(fā)酵液對(duì)S.aureus 的抑菌圈直徑為（24.0±0.63） mm；過(guò)氧化氫酶處理后，菌株A32 發(fā)酵液的抑菌圈直徑為（18.3±0.33） mm，表明當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min 時(shí)，菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素能力最強(qiáng)。

綜合單因素試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化氫酶處理前后，菌株A32 的發(fā)酵液的抑菌圈大小的變化趨勢(shì)一致，表明菌株A32 發(fā)酵液的抑菌能力跟菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素能力具有一致性。為此，在后期產(chǎn)細(xì)菌素發(fā)酵條件的優(yōu)化過(guò)程中，用菌株A32 發(fā)酵液抑菌圈的大小來(lái)反映菌株A32 所產(chǎn)細(xì)菌素能力。

2.7 PB 試驗(yàn)結(jié)果

設(shè)計(jì)12 組PB 試驗(yàn)，對(duì)培養(yǎng)基組分：高粱粉添加量（A）、綠豆粉添加量（B），發(fā)酵條件：料液比（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）、搖床轉(zhuǎn)速（E） 及培養(yǎng)基起始pH 值（F） 共6 個(gè)因素進(jìn)行研究，根據(jù)前期試驗(yàn)確定各因素水平，響應(yīng)值為未經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理的菌株A32 發(fā)酵液對(duì)S.aureus 的抑菌性大小，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Plackets-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Minitab17 軟件對(duì)其結(jié)果進(jìn)行方差分析（表4）?；貧w方程為菌株A32 發(fā)酵液抑菌圈直徑X=15.879+1.001A+1.206B -0.204C+1.124D -0.166E+0.359F，對(duì)模型進(jìn)行匯總，判定系數(shù)R2=0.922 5，該模型的擬合度較好，且模型P=0.012，表明該篩選模型顯著。根據(jù)表中顯著性分析可知，高粱粉添加量（P=0.011）、綠豆粉添加量（P=0.005）、發(fā)酵時(shí)間（P=0.007） 三者P 值均小于0.05，在α=0.05 的概率水平上差異顯著。因此，選擇高粱粉添加量、綠豆粉添加量、發(fā)酵時(shí)間3 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

表4 Plackets-Burman 試驗(yàn)方差分析

2.8 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在PB 試驗(yàn)結(jié)果分析的基礎(chǔ)上，用Design-Expert 軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)因素組合表及結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

應(yīng)用Design-Expert 軟件對(duì)所得的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，獲得菌株A32 發(fā)酵液的抑菌圈直徑對(duì)高粱粉添加量、綠豆粉添加量、發(fā)酵時(shí)間的二次多項(xiàng)式回歸方程式分別如下：

菌株A32 發(fā)酵液的抑菌圈直徑X=25.68+1.15A-0.15B-0.12C+1.05AB-0.70AC+0.65BC-1.82A2-2.07B2-4.06C2；

表6 響應(yīng)面優(yōu)化二階回歸模型方差分析

根據(jù)表6 方差分析結(jié)果確定，建立模型的失擬項(xiàng)均不顯著，R2為0.905 7，說(shuō)明該模型的擬合性比較高、誤差小，可以采用此模型（回歸方程） 代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行相關(guān)預(yù)測(cè)和分析。同時(shí)，由回歸方程回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，二次項(xiàng)系數(shù)A2、B2、C2的值均小于0.05，說(shuō)明多個(gè)試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響具有顯著作用；而高粱粉添加量、綠豆粉添加量、發(fā)酵時(shí)間兩兩之間的交互作用不顯著。

利用響應(yīng)面軟件進(jìn)行計(jì)算分析可得出菌株A32食品級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方和發(fā)酵條件為：高粱粉添加量4.6 g/100 mL，綠豆粉添加量2.9g/100 mL，發(fā)酵時(shí)間59.2 h。為驗(yàn)證上述試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，在此最優(yōu)條件下對(duì)菌株A32 食品級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方和發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證，做3 次平行試驗(yàn)，得出菌株A32 發(fā)酵液對(duì)S.aureus 的抑菌圈直徑為（25.9±0.252） mm，與預(yù)測(cè)值都十分相近，說(shuō)明模型方程與實(shí)際情況擬合較好，具有可靠的現(xiàn)實(shí)意義。因此確定高粱粉添加量4.7 g/100mL，綠豆粉添加量3.0 g/100mL，NaCl 添加量1 g/100mL，發(fā)酵時(shí)間為60 h，發(fā)酵初始pH6，搖床轉(zhuǎn)速140 r/min，即可保證能夠得到較高產(chǎn)量的細(xì)菌素。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)菌株A32 食品級(jí)培養(yǎng)基原料的篩選，得到其最佳碳源為高粱粉、氮源為綠豆粉；在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)PB 試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到菌株A32 產(chǎn)細(xì)菌素能力最佳的發(fā)酵條件為：高粱粉添加量4.7 g/100mL，綠豆粉添加量3.0 g/100mL，NaCl 添加量1 g/100mL，發(fā)酵時(shí)間60 h，發(fā)酵初始pH6，搖床轉(zhuǎn)速140 r/min。