基于美國(guó)高加索人群瘦體重的全基因組關(guān)聯(lián)研究

冉 姝， 劉 宇， 張宇雪， 劉寶林

（上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

肌少癥（sarcopenia）是與增齡相關(guān)的、進(jìn)行性的全身肌量減少和（或）肌強(qiáng)度下降或肌肉生理功能減退的綜合癥[1-2]。肌少癥和骨質(zhì)疏松癥相伴出現(xiàn)，致使老年人易于跌倒和骨折，繼而成為老年人群致殘、致死的主要原因之一[3-4]。中國(guó)城市地區(qū)高齡男性肌少癥的患病率為12.3%，女性為4.8%，農(nóng)村高齡男性肌少癥患病率為6.4%，女性為 11.5%[5]。最近一項(xiàng)研究估計(jì)全球肌少癥的患病率為10%[6]。預(yù)計(jì)到2050 年，髖部一個(gè)部位的跌倒骨折人數(shù)就將達(dá)到600 萬(wàn)，造成254 億美元的直接治療費(fèi)用以及更高的術(shù)后護(hù)理費(fèi)用[7]。肌少癥將是未來(lái)面臨的主要健康問(wèn)題之一。

肌少癥的核心是骨骼肌數(shù)量和質(zhì)量的丟失，在研究其發(fā)病因素及防治方法時(shí)應(yīng)主要考慮這兩個(gè)方面。使用雙能X 線骨密度儀（DXA）測(cè)量的瘦體重（LBM）是肌少癥的重要性狀[8]。LBM 受遺傳控制，遺傳度在50%～80%之間[9]。與肌少癥高度相關(guān)的其他性狀的研究中發(fā)現(xiàn)，握力的遺傳度為32%～77%[10-11]，肌肉橫截面積的遺傳度為70%～90%[12]。因此，LBM 顯著的遺傳度為肌少癥遺傳學(xué)研究提供了良好的理論基礎(chǔ)。瘦體重指數(shù)（LMI）為瘦體重與身高的平方之比[13]。

全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）是一種通過(guò)掃描整個(gè)基因組,鑒定出與復(fù)雜疾病或復(fù)雜性狀相關(guān)的遺傳因素的研究方法。目前GWAS 研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多SNPs（單核苷酸多態(tài)性）與瘦體重相關(guān)。2009 年，Liu 等[14]對(duì)1 000 名白人全身瘦體重進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā) 現(xiàn) 位 于 TRHR 基 因 的 SNPs（ rs16892496 和rs7832552）與LBM 顯著關(guān)聯(lián)。Guo 等[15]以1 627 名中國(guó)人作為實(shí)驗(yàn)樣本、2 286 名歐洲白人作為驗(yàn)證樣本進(jìn)行雙變量全基因組關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)與葡萄糖代謝和能量代謝相關(guān)的GLYAT 基因與四肢瘦體重（appendicular lean mass, ALM）關(guān)聯(lián)。Urano 等[16]對(duì)1 081 名日本絕經(jīng)后婦女進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)PRDM16 基因在調(diào)節(jié)LBM 中有重要作用。2017 年，Zillikens 等[17]對(duì)38 292 名歐洲人全身LBM 和28 330名歐洲人ALM 進(jìn)行大規(guī)模關(guān)聯(lián)分析，并分別在63 475和45 090 名不相關(guān)的歐洲人群中進(jìn)行驗(yàn)證，研究發(fā)現(xiàn)VCAN，ADAMTSL3，IRS1 和FTO 基因與全身LBM 和ALM 相 關(guān) 聯(lián)。2019 年，Pei 等[18]對(duì)來(lái)自弗雷明漢心臟研究隊(duì)列內(nèi)6 587 名受試者的腿部瘦體重進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)位于6p21.1 處的兩個(gè)功能變體（rs524533 和rs571770）與LBM 有關(guān)，并通過(guò)Cis-eQTL 分析發(fā)現(xiàn)這些SNPs 與NFKBIE基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)。

為了鑒定與肌少癥相關(guān)聯(lián)的基因，本研究對(duì)2 283 名不相關(guān)的美國(guó)高加索人樣本進(jìn)行基于基因水平的關(guān)聯(lián)分析，并在1 000 名不相關(guān)的美國(guó)高加索人樣本中驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 樣本

研究參與者是從美國(guó)奧馬哈市（Omaha）和堪薩斯城（Kansas）及其周邊地區(qū)招募的健康個(gè)體，研究得到了克瑞頓大學(xué)和密蘇里大學(xué)堪薩斯分校倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有研究者在進(jìn)入研究之前都提供了書面知情同意書，并且完成了包括生活方式、病史、家庭信息等相關(guān)問(wèn)卷調(diào)查。研究采用肌少癥遺傳研究中廣泛應(yīng)用的排除標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣本進(jìn)行篩選，避免出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

研究樣本由2 283 名不相關(guān)的美國(guó)高加索受試者組成，包括556 名男性和1 727 名女性。驗(yàn)證樣本由1 000 名不相關(guān)的美國(guó)高加索人組成，包括501 名男性和499 名女性。研究樣本和驗(yàn)證群組之間沒(méi)有重疊。

使 用Hologic 公 司 的DXA4500（Hologic Inc.,Bedford, MA, USA）骨密度儀對(duì)研究者進(jìn)行瘦體重和脂肪量的測(cè)量。

1.2 基因分型和質(zhì)量控制

a. 研究樣本。抽取每位受試者10 mL 的外周靜脈血。本研究采用標(biāo)準(zhǔn)的DNA 提取試劑盒進(jìn)行DNA 提取，提取后采用Beckman 公司的DU530 核酸/蛋白分析儀（Beckmanlnc., Fullerton，CA.UK）進(jìn)行濃度和純度的測(cè)量。采用Genome-Wide Human SNP Array 6.0 芯片（Affymetrix, Santa Clara, CA, USA）對(duì)研究樣本進(jìn)行基因分型,并在個(gè)體和SNP 水平上執(zhí)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制步驟。在個(gè)體水平，使用PLINK軟件根據(jù)X 染色體上的基因型數(shù)據(jù)推斷出個(gè)體的性別，并與問(wèn)卷中記錄的性別作比較，將不明確的以及與報(bào)告性別不一致的個(gè)體刪除。在SNP 水平，所挑選的SNP 符合以下條件：最低基因分型率為95%；哈迪溫伯格平衡值大于0.001；等位基因頻率大于0.01。最后有746 709 個(gè)SNPs 保留在研究樣本中。

b. 驗(yàn)證樣本。基因分型采用Affymetrix 250K Nsp 和Affymetrix 250K Sty，過(guò)程按標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行，共有379，319 個(gè)SNPs 用于關(guān)聯(lián)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

研究以瘦體重指數(shù)（LMI）作為表型，采用SPSS 19.0 軟件對(duì)性別、年齡、年齡的平方和脂肪量進(jìn)行協(xié)變量校正。為了避免因群體分層現(xiàn)象而導(dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果, 采用主成分分析法（principal component analysis, PCA）校正2 283 名美國(guó)高加索人樣本中潛在的種群分層。在樣本中挑選一組無(wú)關(guān)樣本并計(jì)算它們的主成分，作為它們的遺傳背景信息。再選用前5 個(gè)主成分, 利用這5 個(gè)主成分值對(duì)表型進(jìn)行校正。使用PLINK 軟件（ http://zzz.bwh.harvard.edu/plink/summary.shtml） 的加性遺傳模式對(duì)校正后的表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。薈萃分析采用Fisher 方法[19]，對(duì)研究樣本和驗(yàn)證樣本的結(jié)果進(jìn)行合并，得到合并p值。

1.4 功能預(yù)測(cè)

采用GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gtexportal.org）和Regulome DB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://regulomedb.org/）進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)目前收集了來(lái)自544 個(gè)人體的基因型和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，提供了跨器官的表達(dá)數(shù)量性狀基因座（eQTL）研究平臺(tái)。Regulome DB 數(shù)據(jù)庫(kù)集合GEO，ENCODE 等項(xiàng)目的數(shù)據(jù)集，通過(guò)評(píng)分對(duì)SNPs 是否處于啟動(dòng)子區(qū)域、增強(qiáng)子區(qū)域、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)以及DNase 敏感區(qū)域進(jìn)行注釋。

2 結(jié) 果

受試者的基本信息如表1 所示。UQCR 基因上的SNPs rs8697（研究樣本p=2.50×10?2，驗(yàn)證樣本p=2.33×10?2，合并p=4.94×10?3）以 及rs56122285（研究樣本p=9.92×10?3，驗(yàn)證樣本p=2.85×10?2，合并p=2.59×10?3）與LMI 關(guān) 聯(lián)。MBD3 基因上的11 個(gè)SNPs 以及TCF3 基因上的3 個(gè)SNPs 與LMI有關(guān)聯(lián)，具體信息列于表2 中。

通過(guò)Regulome DB 查詢r(jià)s8110543 和rs7252741的DB 得分分別為1b 和1f。得分為1b 的變體對(duì)功能具有很高的置信度，rs8110543 不僅位于DNase敏感區(qū)域，還是轉(zhuǎn)錄因子與eQTL 的結(jié)合位點(diǎn)。DNase 敏感區(qū)域的DNA 特別活躍而且具有順式調(diào)節(jié)的作用，在一定程度上可以說(shuō)DNase 敏感區(qū)域表示轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的控制區(qū)域。

采用GTEx 對(duì)SNPs 進(jìn)行eQTL 分析，發(fā)現(xiàn)16 個(gè)SNPs 的eQTL 靶基因都是UQCR，并起到順式調(diào)節(jié)的作用（表2）。GTEx 查詢得到UQCR 基因在骨骼肌表達(dá)圖（圖1）和 rs8697，rs56122285 的eQTL 圖（圖2 和圖3），N為樣本容量。TPM為每百萬(wàn)映射讀取的轉(zhuǎn)錄本。

圖 1 UQCR11（UQCR）eQTL 基因骨骼肌表達(dá)圖Fig. 1 Structure of the eQTL gene skeletal muscle expression of UQCR11（UQCR）

表 1 研究樣本和驗(yàn)證樣本的基本信息Tab.1 Information of the discovery sample and replication sample

表 2 19p13.3 顯著SNP 和相關(guān)基因的eQTL 分析結(jié)果Tab.2 19p13.3 eQTL analysis results about significant-association SNP and genes

圖 2 rs8697 的eQTL 基因表達(dá)圖Fig. 2 Strueture of the eQTL gene expression of rs8697

圖 3 rs56122285 的eQTL 基因表達(dá)圖Fig. 3 Strueture of the eQTL gene expression of rs56122285

使用STRING 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)對(duì)TCF3,MBD3 相關(guān)肌肉代謝蛋白進(jìn)行分析（如圖4 所示）。MBD3蛋白是抑制性核小體重塑和去乙酰化酶（NuRD）復(fù)合物的核心成分，具有保守的甲基CpG 結(jié)合域[20-21]。TCF3 蛋白靶基因的表達(dá)限于特定的細(xì)胞譜系，通過(guò)含有TCF3 和組織限制性螺旋?環(huán)?螺旋（bHLH）因子的異二聚體來(lái)激活細(xì)胞特異性基因表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞分化[22]。這種譜系選擇機(jī)制在骨骼肌的分化中得到了清楚的闡釋[23-24]。

圖 4 TCF3 及MBD3 與肌肉代謝蛋白的STRING 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)Fig. 4 STRING protein interaction network between TCF3 and MBD3 and muscle metabolic proteins

3 討 論

UQCR（ubiquinolcytochrome c reductase）泛醌細(xì)胞色素c 還原酶、產(chǎn)物線粒體復(fù)合物III 是電子傳遞鏈上的核心元素，在輔酶Q 氧化和細(xì)胞色素c 還原的過(guò)程中起到介導(dǎo)的作用[25]。復(fù)合物III 在高等哺乳動(dòng)物中由11 個(gè)亞基組成，其中，有3 個(gè)是催化亞基，分別是細(xì)胞色素b、細(xì)胞色素c1 和Rieske 鐵硫蛋白[26]。在三磷酸腺苷（ATP）的生化合成過(guò)程中可以催化電子使其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞色素b，還能利用能量在線粒體膜上轉(zhuǎn)移質(zhì)子。在兒童和成年人的神經(jīng)肌肉和非神經(jīng)肌肉疾病患者中發(fā)現(xiàn)線粒體復(fù)合物III 缺乏[27]。

MBD3（methyl-CpG binding domain protein 3）甲基CpG 結(jié)合域蛋白3 是組成NuRD 復(fù)合物的一個(gè)亞基。此外，NuRD 還是由HDAC1（組蛋白脫乙酰酶1）、HDAC2、MTA2 和RBBP7 等組成的多亞基復(fù)合物[28]，其在DNA 的損傷修復(fù)過(guò)程以及DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要功能。HDAC1 可以使生肌決定因子（MYOD）去乙?；⒆柚筂YOD 在分化條件下啟動(dòng)肌源性程序[29]。在肌細(xì)胞分化時(shí)，HDAC1水平的降低與MYOD 乙?；降脑黾佑嘘P(guān)，后者會(huì)刺激轉(zhuǎn)錄[30]。

TCF3（transcription factor 3）轉(zhuǎn)錄因子3 可以編碼螺旋?環(huán)?螺旋（helix-loop-helix）結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子E12（免疫球蛋白轉(zhuǎn)錄因子?1）和E47（轉(zhuǎn)錄因子?3）[31]。E12 和E47 兩種因子可以與生肌決定因子（MYOD）和 肌細(xì)胞生成素（MYOG）相互作用，參與肌細(xì)胞特異性bHLH 蛋白的二聚化[24]。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族包括MYOD，MYOG，生肌因子5（MYF5），生肌因子6（MYF6）和生肌調(diào)節(jié)因子4（MRF4），它們可以調(diào)節(jié)肌源性細(xì)胞分化，然后再融合成肌纖維[32]。

采用全基因組關(guān)聯(lián)分析方法，在2 283 名不相關(guān)的美國(guó)高加索人中發(fā)現(xiàn)位于基因UQCR，MBD3和TCF3 的16 個(gè)SNPs 與LMI 有關(guān)。這16 個(gè)SNPs都具有eQTL 效應(yīng)，可能會(huì)影響或者導(dǎo)致肌少癥。