酸堿脅迫對鱖血清pH、耗氧率及解毒相關(guān)基因表達(dá)的影響

張成碩，周昊天，曾萌冬，王艷玲，趙金良，趙 巖

(上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306)

水體的酸堿度是影響魚類生活的重要環(huán)境因素[1]。淡水的緩沖能力較差，其酸堿度波動范圍較大。對于池塘養(yǎng)殖而言，水體pH的晝夜波動可達(dá)到6.6～10.2[2]。近年來，國內(nèi)工業(yè)快速發(fā)展導(dǎo)致酸雨愈加頻繁，河流兩岸堿性粉煤灰、氧化鈣等違法亂排，以及養(yǎng)殖過程中殘留餌料過多、藥物的濫用及養(yǎng)殖密度過大等都加劇了水體pH變化[3-4]。酸堿環(huán)境變化(酸堿脅迫)對魚類生長性能、物質(zhì)代謝、免疫防御等方面的影響十分明顯[5-9]。

化學(xué)防御系統(tǒng)是生物抵御環(huán)境中化學(xué)脅迫和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制。解毒酶系(生物轉(zhuǎn)化酶系)是化學(xué)防御系統(tǒng)的核心組分。有毒害的疏水化合物在這些酶的作用下，轉(zhuǎn)化為更親水的衍生物從生物體中排除[10-11]。目前，在人類藥物代謝[12]，植物適應(yīng)逆境環(huán)境脅迫(干旱、高溫、重金屬[13-14]等)，水生動物接觸化學(xué)藥劑(除草劑、殺蟲劑[15-17]等)過程中均有關(guān)于生物化學(xué)防御機(jī)制的研究報道。但魚類為適應(yīng)水環(huán)境pH變化調(diào)動化學(xué)防御機(jī)制，進(jìn)行的一系列生物轉(zhuǎn)化尚缺乏系統(tǒng)深入的研究。

鱖(Sinipercachuatsi)屬鱸形目鮨科鱖亞科鱖屬，俗稱桂花魚，是我國重要的名貴淡水經(jīng)濟(jì)魚類[18]。鱖魚養(yǎng)殖對水質(zhì)要求較高[19-20]，對酸堿環(huán)境脅迫的適應(yīng)機(jī)制有自身的特點。為了解酸堿脅迫對鱖的影響以及相應(yīng)解毒作用，本研究對鱖進(jìn)行不同pH的急性脅迫，測定72 h血清pH、耗氧率、CYP450、FMO、UGT和GST基因相對表達(dá)量的變化過程，從生理生化角度揭示酸堿對鱖的毒性及其適應(yīng)機(jī)制，為其健康養(yǎng)殖與生產(chǎn)應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用鱖取自于上海市浦東新區(qū)孫農(nóng)水產(chǎn)養(yǎng)殖場。選取體質(zhì)健康、規(guī)格基本一致，平均體重為(30±5)g的個體進(jìn)行實驗。于上海海洋大學(xué)養(yǎng)殖中心控溫循環(huán)水族箱中暫養(yǎng)一周，每天投喂活餌料魚，及時清理殘餌和糞便，保證實驗魚的正常生理活動。實驗前24 h停止喂食。試驗用水為曝氣48 h以上的自來水，水溫(24.6±0.5)℃，pH為(7.5±0.1)，溶解氧大于5 mg/L。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集和處理

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，用1 mol/L HCI和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)實驗液pH，設(shè)置酸堿度分別為4.0、5.5、7.0、8.5、10.0。實驗在透明水族箱(55 L)中進(jìn)行。實驗時，將實驗魚從水族箱內(nèi)取出，直接放入實驗組中，每組12尾，實驗期間不投喂餌料，實驗開始后，每隔5 h調(diào)整實驗液一次，充氧1 h，每隔24 h更換實驗液，脅迫后0、3、12、24、48、72 h進(jìn)行采樣。每組隨機(jī)取2尾。

用1 mL一次性無菌注射器從魚尾靜脈處抽血，每尾魚抽血時間不超過5 min，血液注入經(jīng)抗凝劑處理的1.5 mL離心管中，4 ℃靜置過夜，分層后離心(1 500 r/min，4 ℃，25 min)，取出上層血清待用。抽血后的實驗魚，冰上解剖，快速取出腦、鰓、肝、腎組織，液氮速凍后，放入-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2.2 血清pH測定

采用FE20-FiveEasy PlusTM pH測定血清pH。為保證血清能浸沒探頭，將分離獲得的血清轉(zhuǎn)移到自制柱狀容器(內(nèi)徑1.5 cm)中測量。同一樣本測量3次，取其平均值。

1.2.3 耗氧率測定

實驗使用的溶氧儀為德國WTW multi3620便攜式水質(zhì)分析儀。實驗組水族箱用保鮮膜封口，透明膠帶固定，確保與空氣隔絕，中間留1圓孔，大小與溶氧儀的傳感器尺寸一致。實驗開始后，每隔1 h測定水體中的溶氧量。用下式計算耗氧率：

1.2.4 細(xì)胞自噬小體的定量檢測 不同濃度槐耳清膏（4、8、16、32mg/ml）作用 NCI-N87 細(xì)胞 24h 后，收集細(xì)胞，用濃度為1μg/ml吖啶橙室溫條件下避光染色20min，離心之后棄染液，用1×PBS清洗3次后，PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)L3通道檢測紅色熒光，F(xiàn)L1通道檢測綠色熒光，紅色熒光增強(qiáng)說明細(xì)胞內(nèi)酸性自噬小體增多。

式中：R0為單位體重耗氧率[mg/(g/h)]，C0、C1為試驗前后水體的溶氧量(mg/L)；V為水體體積(L)；T為試驗持續(xù)時間(h)；W為魚體總體質(zhì)量(g)。

1.2.4 熒光定量PCR

腦、鰓、肝、腎研磨成粉末后，按照TRIzol?Reagent(Invitrogen)說明書提供的方法提取總RNA，使用核酸蛋白測定儀和瓊脂糖凝膠電泳測定RNA的完整性，加入適量的RNase free ddH2O調(diào)整至1 000 ng/μL。用Prime ScriptRRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒合成cDNA第一鏈，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20 ℃冰箱保存待用。

根據(jù)GenBank中鱖GST(GenBank登錄號：EU719618.1)和UGT、CYP450、FMOcDNA序列(本實驗室所測鱖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù))，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(表1)，引物由金唯智(蘇州)生物科技有限公司合成。

表1 定量PCR分析的引物序列

實時熒光定量PCR擴(kuò)增體系如下(20 μL)：10 μL TB GreenTM Premix EX TaqTM(TaKaRa)，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA 1 μL，RNase-free water定容至20 μL。每個樣本做3個重復(fù)，以β-actin為內(nèi)參建立標(biāo)準(zhǔn)曲線以及溶解曲線。在MyiQ5熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s；變性95 ℃ 5 s，延伸 60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。數(shù)據(jù)分析采用CFX Manager軟件進(jìn)行，基線值、閾值和閾循環(huán)值由軟件自動設(shè)定，采取相對定量2-ΔΔCt法計算表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析，單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗，Duncan多重比較檢測各測量指標(biāo)的差異，以P<0.05為差異顯著。利用Sigmaplot 10.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸堿脅迫對鱖的行為影響

實驗鱖放入pH=7的組中無明顯應(yīng)激現(xiàn)象，游動平緩正常，水質(zhì)無變化。其他處理組中鱖在放入后表現(xiàn)為快速游動，尾部擺動幅度較大，鰓蓋擴(kuò)張速率較快，隨后游動逐漸減緩，魚體懸浮靜止。其中，在pH=4與pH=10兩組的脅迫過程中，鱖體色明顯變淺，體表分泌物增多，形成一層灰白色薄膜，水質(zhì)較為渾濁。在脅迫過程的后期，鱖時而出現(xiàn)亂沖撞現(xiàn)象，魚體發(fā)生微斜，不能保持平衡，眼部稍有凸起。實驗過程中沒有出現(xiàn)死魚現(xiàn)象。

2.2 酸堿脅迫對鱖血清pH的影響

pH=7組鱖血清pH較穩(wěn)定，維持在7.31～7.43，其他各酸堿度處理組中，脅迫3 h后鱖血清pH均發(fā)生顯著變化。pH=4組的鱖血清pH始終呈持續(xù)下降趨勢，于72 h達(dá)到6.20。pH=5.5組的鱖血清pH呈先下降后上升再下降的變化趨勢。pH=8.5組和pH=10組的鱖血清pH呈先上升后下降再上升趨勢(表2)。

表2 酸堿脅迫對鱖血清pH的影響

2.3 酸堿脅迫對鱖耗氧率的影響

不同酸堿度脅迫對鱖耗氧率的影響結(jié)果如圖1所示。組內(nèi)方差分析結(jié)果顯示，各實驗組間存在極顯著性差異。隨著脅迫時間的增加，除pH=7組耗氧率變化趨勢較為穩(wěn)定外，其余各實驗組耗氧率在12 h后均呈現(xiàn)出先升高再降低的變化趨勢，其中，pH=8.5組耗氧率峰值出現(xiàn)在36 h；pH=4、pH=5.5與pH=10組耗氧率峰值均出現(xiàn)在42 h。另外pH=4組其耗氧率在12 h后較同一時段不同pH脅迫組均處于最低的狀態(tài)。單因素方差分析得出，pH對鱖耗氧率的影響極顯著。

圖1 不同酸堿度脅迫對鱖耗氧率的影響

2.4 酸堿脅迫對鱖不同組織解毒反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.4.1 酸堿脅迫對鱖肝臟組織中解毒基因表達(dá)的影響

如圖2所示，pH=7組鱖肝臟各相關(guān)解毒基因的相對表達(dá)量無顯著變化，而其余各實驗組相關(guān)解毒基因的相對表達(dá)量在酸堿脅迫過程中呈明顯先升高后降低的變化趨勢。其中，在酸堿脅迫3 h后，UGT基因與GST基因開始顯著升高，脅迫12 h后，CYP450基因與FMO基因開始顯著升高，此時GST基因相對表達(dá)量達(dá)最高值，隨后呈下降趨勢。在脅迫48 h后，CYP450、FMO與UGT基因相對表達(dá)量均達(dá)到最高值，至脅迫72 h相對表達(dá)量下降，但顯著高于pH=7組。

圖2 酸堿脅迫對鱖肝臟組織中解毒基因表達(dá)的影響

2.4.2 酸堿脅迫對鱖腎臟組織中解毒基因表達(dá)的影響

如圖3所示，在72 h的酸堿脅迫過程中，pH=7組鱖腎臟各相關(guān)解毒基因的相對表達(dá)量無顯著變化，而其余各實驗組相關(guān)解毒基因的相對表達(dá)量在脅迫過程中呈明顯先升高后降低的變化趨勢。其中，pH=8.5組與pH=10組各基因相對表達(dá)量均在脅迫48 h后達(dá)最高值，至脅迫72 h相對表達(dá)量下降。脅迫3 h后CYP450基因與UGT基因開始顯著升高，脅迫12 h后，F(xiàn)MO基因與GST基因開始顯著升高。至脅迫24 h后，pH=5.5組的CYP450基因與FMO基因達(dá)到最高值，隨后呈下降趨勢。

圖3 酸堿脅迫對鱖腎臟組織中解毒基因表達(dá)的影響

2.4.3 酸堿脅迫對鱖腦中解毒基因表達(dá)的影響

如圖4所示，在72 h的酸堿脅迫過程中，pH=7組鱖腦部各相關(guān)解毒基因的相對表達(dá)量無顯著變化，而其余各實驗組相關(guān)解毒基因的相對表達(dá)量在脅迫過程中呈明顯先升高后降低的變化趨勢。脅迫3 h后，除pH=7組外，各實驗組相關(guān)解毒基因的相對表達(dá)量均開始顯著升高，至脅迫24 h后，除pH=7外，各實驗組UGT基因均達(dá)最高值，隨后呈下降趨勢。脅迫48 h后，CYP450、FMO與GST基因相對表達(dá)量均達(dá)到最高值，至脅迫72 h后表達(dá)量下降。

圖4 酸堿脅迫對鱖腦中解毒基因表達(dá)的影響

2.4.4 酸堿脅迫對鱖鰓中解毒基因表達(dá)的影響

在72 h的酸堿脅迫過程中，pH=7組鱖鰓部各相關(guān)解毒基因的相對表達(dá)量無顯著變化，而其余各實驗組相關(guān)解毒基因的相對表達(dá)量在脅迫過程中呈明顯先升高后降低的變化趨勢(圖5)。脅迫12 h后，除pH=7組外，各實驗組相關(guān)解毒基因的相對表達(dá)量均開始顯著升高，至脅迫24 h后，除pH=7外，各實驗組UGT基因與GST基因均達(dá)最高值，隨后呈下降趨勢。脅迫48 h后，各實驗組CYP450基因與FMO基因相對表達(dá)量均達(dá)到最高值，至脅迫72 h后表達(dá)量下降。

圖5 酸堿脅迫對鱖鰓中解毒基因表達(dá)的影響

3 討論

3.1 酸堿脅迫對鱖血清pH的影響

3.2 酸堿脅迫對鱖耗氧率的影響

魚類的大多數(shù)代謝活動都離不開氧的參與，耗氧率能夠反應(yīng)魚類的生理狀況。朱愛意等[24]研究發(fā)現(xiàn)，魚體可以通過改變代謝狀況，消耗較多的能量以適應(yīng)外界環(huán)境pH變化，但超出一定范圍，耗氧率會降低。例如長鰭籃子魚(Siganuscanaliculatus)幼魚在pH=6.0時耗氧率最低，pH=9.0時耗氧率最高[25]。pH值為8.2～9.2時，米諾魚的耗氧率顯著高于其他pH時的水平[26]。本研究中，pH=5.5、8.5、10組中耗氧率在脅迫24 h后均出現(xiàn)上升趨勢，且在36～60 h間耗氧率均超過pH=7組，而pH=4組中鱖耗氧率均處于最低狀態(tài)，說明水體環(huán)境pH=5.5～10，鱖通過提高耗氧率、消耗更多的能量來適應(yīng)酸堿脅迫，而pH4的酸性環(huán)境對鱖的耗氧率有強(qiáng)烈的抑制作用。

3.3 酸堿脅迫下鱖不同組織中解毒反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)

對于水體中存在的氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫等有毒物質(zhì)，pH的劇烈波動均能夠使這些有毒物質(zhì)毒性加強(qiáng)，從而致使魚類中毒[27-28]。環(huán)境脅迫下的生物將會啟動生物體化學(xué)防御，通過生物轉(zhuǎn)化過程將各種有機(jī)或無機(jī)的毒物(包括各種藥物、環(huán)境毒素和酚類物質(zhì)等)主動排出體外[29]。具體而言，Ⅰ相酶將有害毒物轉(zhuǎn)化為親水性的酚或親電性的苯醌和環(huán)氧化物，Ⅱ相酶與之結(jié)合，在運(yùn)輸酶的作用下排出體外[10]。研究報道，細(xì)胞色素P450等代謝基因能夠清除貽貝毒素對大西洋鮭(Salmosalar)的毒害作用[30]；GST基因參與去除淡水魚類微囊藻毒素的過程[31]；斑馬魚(Daniorerio)UGT超家族在葡糖醛酸化過程中，使葡糖醛酸與內(nèi)源或外源底物的羧基、硫基等基團(tuán)結(jié)合形成毒性更低的葡糖苷酸[32]；劉雨等[33]在鱖幼魚的急性氨氮脅迫實驗中發(fā)現(xiàn)，脅迫初期谷胱甘肽(GSH)基因表達(dá)量會出現(xiàn)上調(diào)趨勢。本研究中，pH=7組中鱖解毒相關(guān)基因(CYP450、FMO、UGT、GST)在不同組織中(肝、腎、腦、鰓)的表達(dá)量始終無顯著變化，其余酸堿脅迫實驗組中在脅迫3 h后，不同組織中基因的表達(dá)量均出現(xiàn)上調(diào)趨勢，說明在外源性酸堿的作用下，鱖魚體內(nèi)會啟動生物體化學(xué)防御來維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，且Ⅰ相反應(yīng)與Ⅱ相反應(yīng)均具有重要作用；酸堿脅迫24～48 h，基因表達(dá)量達(dá)到峰值，隨后呈下降趨勢，這與耗氧率在此時間段內(nèi)變化趨勢相同，說明鱖在去除酸堿脅迫產(chǎn)生的毒性的過程中需要消耗能量；脅迫72 h后，酸堿實驗組的基因表達(dá)量均出現(xiàn)下調(diào)，這可能是因為鱖在此脅迫環(huán)境下的逐漸適應(yīng)；另外，酸度與堿度實驗組的基因表達(dá)量總體差異不大，這或許與解毒過程中的作用底物類似有關(guān)。