長江上游5個草魚群體的遺傳多樣性

翟東東，蔡 金，喻記新，劉紅艷，陳元元，熊 飛，段辛斌，劉紹平，陳大慶

(1.江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北省漢江流域特色生物資源保護(hù)開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，武漢 430056；2.江漢大學(xué)，持久性有毒污染物環(huán)境與健康危害湖北省重點實驗室，武漢 430056；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223)

草魚(Ctenopharyngodonidellus)，隸屬于鯉科雅羅魚亞科草魚屬，和青魚、鰱、鳙合稱“四大家魚”，是我國重要的淡水魚類資源[1]。然而，由于過度捕撈、水電開發(fā)、水體污染等因素的影響，從20世紀(jì)80年代起，長江四大家魚種群數(shù)量急劇下降，資源嚴(yán)重衰退[2-3]。長江四大家魚資源保護(hù)和恢復(fù)頗受關(guān)注，但相關(guān)研究主要集中在三峽大壩以下的長江中下游江段[4-6]，關(guān)于長江上游的研究相對較少。目前，關(guān)于長江上游草魚的研究主要集中在資源量等方面[7-9]。在遺傳資源方面，傅建軍等[10,11]利用線粒體D-Loop區(qū)序列和微衛(wèi)星標(biāo)記報道了木洞、萬州江段草魚的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，廖小林等[12]利用微衛(wèi)星標(biāo)記報道了宜賓江段草魚的遺傳多樣性。目前，對三峽大壩、向家壩等水電工程建設(shè)后長江上游草魚的遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)還缺乏全面的了解。

本研究以長江上游5個不同群體的草魚為研究對象，通過線粒體Cytb基因研究其遺傳多樣性、種群分化和歷史動態(tài)，旨在較全面地了解三峽大壩、向家壩等水電工程開發(fā)建設(shè)后長江上游草魚的遺傳多樣性格局，為長江上游草魚等家魚的遺傳多樣性保護(hù)和管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

本研究的草魚群體樣本于2017-2019年采集自長江上游5個不同的江段，分別為邵女坪、巴南、萬州、太平溪和合川。邵女坪位于向家壩庫區(qū)，巴南、萬州、太平溪分別位于三峽庫區(qū)庫尾、庫中和庫首，合川位于長江上游一級支流嘉陵江。邵女坪江段和巴南、萬州、太平溪等江段被向家壩阻隔，合川和巴南、萬州、太平溪被草街水電站、井口水電站阻隔(圖1)。物種鑒定主要參考《中國動物志 硬骨魚綱 鯉形目(中卷)》[13]。采集的草魚的標(biāo)準(zhǔn)體長、體重和年齡數(shù)據(jù)見表1，另外取魚體背部肌肉保存于95%的酒精中，并存放于-20 ℃，以用于DNA提取。

表1 長江上游5個草魚群體的樣本信息和遺傳多樣性

圖1 長江上游草魚采樣點

1.2 基因組DNA提取以及PCR擴(kuò)增、測序

取肌肉約50 mg，利用成都福際生物技術(shù)有限公司的動物組織基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。線粒體DNA Cytb片段的擴(kuò)增引物為L14724 5′-GAC TTG AAA AAC CAC CGT TG-3′(正向)和H15915 5′-CTC CGA TCT CCG GAT TAC AAG AC-3′(反向)[14]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)的反應(yīng)總體積為30 μL：15 μL 2×Taq PCR MasterMix(含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液，北京艾德萊生物科技有限公司)，模板DNA 3 μL，正反向引物各1 μL，ddH2O 10 μL。PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性4 min，然后進(jìn)行35個循環(huán)，循環(huán)步驟為94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，最后再72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳驗證后，將目的條帶準(zhǔn)確清晰的樣品送至天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司，完成純化回收和序列測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用MEGA7對序列進(jìn)行比對，然后參照測序峰圖，對序列進(jìn)行編輯和校正[15]。運用DnaSP v5.10計算單倍型數(shù)目、單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)[16]。使用Arlequin version 3.0[17]進(jìn)行分子方差變異分析(AMOVA)和計算成對遺傳分化指數(shù)(FST)[18]。通過MEGA7來構(gòu)建NJ(Neighbor-joining)和UPGMA(Unweighted pair group method using arithmetic average)系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。使用Network 4.6中的中接法(Median-joining)構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖[19]。通過DnaSP v5.10軟件進(jìn)行錯配分析來驗證群體在歷史上是否發(fā)生過種群擴(kuò)張[16]。

2 結(jié)果

2.1 序列變異特征

本研究總計獲得了133個個體的Cytb全序列，序列長度為1 140 bp，序列中無堿基的插入和缺失。平均堿基組成為A+T的含量為58.3%，G+C的含量為41.7%。在這133條Cytb序列中，共有10個變異位點，占總位點數(shù)的0.88%，其中有6個為簡約信息位點，另4個為單一變異位點。

2.2 遺傳多樣性與歷史動態(tài)

本研究總共獲得了10種單倍型(GenBank登錄號：MN923194-MN923203)，每一個群體的單倍型數(shù)目為4到7種。5個群體的單倍型多樣性變化范圍為0.618到0.800，邵女坪群體最低，萬州群體最高，整體單倍型多樣性為0.732；核苷酸多樣性的變化范圍為0.088%到0.112%，巴南群體最低，萬州群體最高，整體核苷酸多樣性為0.100%(表1)。

邵女坪、巴南、萬州、太平溪、合川群體的錯配分析圖都呈單峰分布，表明這5個草魚群體在歷史上都發(fā)生過種群擴(kuò)張(圖2)。

圖2 5個草魚群體和整個群體的錯配分析圖

2.3 遺傳分化

分子方差變異(AMOVA)分析顯示96.96%的變異來自群體內(nèi)部，僅有3.04%的變異來自群體之間，表明長江上游草魚群體的遺傳變異主要來自群體內(nèi)部(表2)。群體之間的遺傳分化指數(shù)FST值如表3，結(jié)果顯示邵女坪群體和合川群體之間存在顯著的遺傳分化，其余群體之間都不存在遺傳分化?；谌后w之間的遺傳距離構(gòu)建的UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹也表明邵女坪群體與合川群體的遺傳距離比其它群體之間的遺傳距離要大(圖3)。

圖3 基于Cyt b基因序列構(gòu)建的草魚群體UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 基于線粒體Cyt b基因的5個草魚群體的分子變異方差分析

表3 基于Cyt b基因分析的5個草魚群體的成對FST值

2.4 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

NJ系統(tǒng)發(fā)育樹表明這10種單倍型分成了2支，單倍型網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果與NJ系統(tǒng)發(fā)育樹吻合。通過單倍型網(wǎng)絡(luò)圖可知2個分支都被5個種群所共享，Hap1，Hap2和Hap4是3個最主要的單倍型，都被5個群體所共享，Hap3、Hap6、Hap9、Hap10雖屬于私有單倍型，但個體較少，分別只有一個個體，因此整體上沒有形成明顯的系統(tǒng)地理格局(圖4)。

圖4 基于Cyt b基因序列構(gòu)建的草魚10種單倍型關(guān)系圖

3 討論

3.1 遺傳多樣性和歷史動態(tài)

單倍型多樣性和核苷酸多樣性是評價種群遺傳多樣性水平高低的兩個重要參數(shù)，其數(shù)值越高，表明群體的遺傳多樣性越高[20]。Lan和Shi[21]認(rèn)為當(dāng)核苷酸多樣性數(shù)值在0.15%～0.47%之間時，表明群體的遺傳多樣性較低。本研究5個草魚群體的整體單倍型多樣性為0.732，處于中等水平；核苷酸多樣性為0.1%，處于很低水平，整體而言，長江上游草魚的遺傳多樣性較低。該結(jié)果與歷史研究一致，廖小林等[12]利用微衛(wèi)星標(biāo)記得到宜賓草魚群體的期望雜合度和觀測雜合度分別為0.648 9、0.574 1，表明長江上游宜賓草魚群體遺傳多樣性較低；傅建軍等[10]和Zhao等[22]利用線粒體基因序列結(jié)果表明長江上游宜賓、木洞、萬州、云陽草魚群體遺傳多樣性較低。另外，研究者利用RAPD、mtDNA、SSR等分子標(biāo)記對長江中、下游部分江段、漢江、湘江、鄱陽湖、洞庭湖等草魚群體的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果也表明草魚的遺傳多樣性較低[10,12,22-23]。

長江水系草魚遺傳多樣性較低的一個重要原因可能是歷史上遭受了瓶頸效應(yīng)和種群擴(kuò)張。Grant和Bowen[24]研究結(jié)果表明，當(dāng)Hd≥0.5、Pi<0.5%時，表明群體是受瓶頸效應(yīng)后迅速擴(kuò)張導(dǎo)致。本研究中5個草魚種群的單倍型多樣性都較高(Hd≥0.5)，而核苷酸多樣性較低(Pi<0.5%)，說明本研究中的5個草魚種群是遭受了瓶頸效應(yīng)之后迅速擴(kuò)張而來。另外，研究表明錯配分析圖呈單峰分布，表明群體經(jīng)歷了種群擴(kuò)張；呈雙峰分布，表明群體沒有經(jīng)歷過種群擴(kuò)張[25]。本研究中5個草魚種群的錯配分析圖都呈單峰分布，也表明這5個種群發(fā)生了種群擴(kuò)張。歷史研究在推測長江中、下游草魚種群歷史動態(tài)時，發(fā)現(xiàn)長江中、下游草魚種群也可能遭受了瓶頸效應(yīng)和種群擴(kuò)張，如Zhao等[22]利用線粒體ND5、ND6、Cyt b和D-Loop四個基因聯(lián)合分析草魚歷史動態(tài)時，推測石首、瑞昌、邗江江段的草魚群體都可能遭受了瓶頸效應(yīng)。此外，近幾十年來長江過度捕撈、水電開發(fā)過度、魚類棲息地喪失、水體污染等因素也可能加劇了草魚遺傳多樣性的喪失。過度捕撈、棲息地喪失、水體污染等因素致使草魚的資源量減少而導(dǎo)致草魚的遺傳多樣性下降。水電開發(fā)則使草魚群體相互隔離，可能通過減小草魚群體的有效種群大小而增加遺傳漂變來減少群體的遺傳多樣性[26]。

3.2 遺傳分化

本研究結(jié)果顯示邵女坪群體和合川群體之間存在顯著的遺傳分化，其余群體之間都不存在遺傳分化，這種遺傳格局的形成可能和水電站大壩的修建以及人工增殖放流活動有關(guān)。研究表明水電站大壩的存在會阻礙壩上、壩下群體的基因交流和增加群體內(nèi)部的遺傳漂變來加大壩上群體與壩下群體的遺傳差異[26-28]。本研究中邵女坪群體和合川群體之間產(chǎn)生了顯著的遺傳分化，可能是邵女坪群體和合川群體被3座水電站大壩分隔，導(dǎo)致它們之間無法產(chǎn)生基因交流而產(chǎn)生遺傳分化。如圖1所描述，邵女坪位于向家壩庫區(qū)，即在向家壩之上，合川位于嘉陵江下游，合川到嘉陵江入江口之間有兩座水電站，分別為草街水電站和井口水電站，這3座水電站使得邵女坪群體和合川群體的草魚無法進(jìn)行基因交流。近些年來，向家壩庫區(qū)、三峽庫區(qū)和嘉陵江合川等地都舉行了多次草魚增殖放流活動，而關(guān)于放流的苗種、親本的遺傳信息并不明確，因此可能在一定程度上影響草魚種群的遺傳分化格局。Gonzalez等[29]研究結(jié)果表明增殖放流對廣島灣不同地點的5個黑鯛野生群體的遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定程度的影響。

4 結(jié)論

長江草魚群體的遺傳多樣性水平較低，主要原因可能是群體在歷史上遭受了瓶頸效應(yīng)以及近幾十年來長江的過度捕撈、水利工程修建、魚類棲息地喪失、水體污染等因素導(dǎo)致的種群數(shù)量銳減。因此，建議加強(qiáng)對長江草魚種質(zhì)資源保護(hù)，采取全面禁漁、生境修復(fù)、原種增殖放流等措施來促進(jìn)長江草魚資源恢復(fù)和遺傳多樣性保護(hù)。另外，邵女坪群體和合川群體已經(jīng)產(chǎn)生了明顯的遺傳分化，因此在保護(hù)工作中，應(yīng)將他們作為不同的管理單元來保護(hù)。

致謝：江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院羅辰浩、令狐清清、李雯等學(xué)生參與了野外樣本采集和部分室內(nèi)實驗，謹(jǐn)致謝意！