暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白的提取工藝優(yōu)化研究*

張家源 張洪才 陳舜勝

暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白的提取工藝優(yōu)化研究*

張家源1,2張洪才1,2陳舜勝1,2①

(1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海 201306；2. 國(guó)家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(上海)食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué)) 上海 201306)

以暗紋東方鲀()精巢組織為原料，采用酸提法提取魚(yú)精蛋白。以得率為指標(biāo)，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，確定了最佳的提取參數(shù)。結(jié)果顯示，提取魚(yú)精蛋白的影響因素重要性依次為：提取次數(shù)>硫酸用量>硫酸濃度>95%乙醇用量；最佳提取工藝條件：硫酸濃度為0.2 mol/L、硫酸用量為2.5倍、提取次數(shù)為2次、95%乙醇用量為2.5倍。在此工藝條件下，暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白的得率為3.82%，蛋白含量達(dá)89.01%。通過(guò)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)可知，提取的粗魚(yú)精蛋白有2個(gè)條帶，分子量分別在25和20 kDa附近。分析其氨酸酸組成發(fā)現(xiàn)，暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白屬于雙魚(yú)精蛋白，其中，精氨酸和丙氨酸含量相對(duì)較高，分別占31.40%和17.39%。本研究對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白更好地應(yīng)用在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要意義。

暗紋東方鲀；魚(yú)精蛋白；提?。还に噧?yōu)化

魚(yú)類(lèi)的精巢俗稱(chēng)魚(yú)白，因其具有特殊的氣味，常被作為廢棄物丟棄，是魚(yú)類(lèi)加工的副產(chǎn)品之一。從魚(yú)類(lèi)的精巢中可以提取到一種堿性蛋白質(zhì)，即魚(yú)精蛋白。魚(yú)精蛋白(Protamine)又稱(chēng)精蛋白，是一種高度聚陽(yáng)離子肽，可代替精子細(xì)胞中的組蛋白，當(dāng)其與DNA結(jié)合時(shí)形成核蛋白，等電點(diǎn)在11~13之間(Xie, 2018; Egawa, 2008; Fu, 2019; Potter, 2005)。魚(yú)精蛋白的分子量較小，由30~50個(gè)氨基酸組成，可溶于水，不溶于丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑，富含核酸、蛋白和微量元素等活性成分(陳金梅等，2015)。由于魚(yú)精蛋白特殊的生物學(xué)組成而使其異于其他蛋白質(zhì)有著獨(dú)特的功能。魚(yú)精蛋白是肝素唯一的拮抗劑，可用于外科手術(shù)后中和肝素，同時(shí)，由于魚(yú)精蛋白具有良好的生物兼容性，因此，可作為運(yùn)輸藥物的載體(Gill, 2006; Kishimoto, 2012; Park, 2017; González-Aramundiz, 2015; Sommers, 2017)。此外，魚(yú)精蛋白還可作為一些食品中的抗菌成分應(yīng)用在食品保鮮領(lǐng)域，具有安全性高、抗菌性能好、熱穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。其在堿性條件下具有明顯的抗菌活性，是一種很有前途的抗菌劑(Guan, 2017)。因此，無(wú)論在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域還是食品領(lǐng)域，魚(yú)精蛋白都有著重要的作用和應(yīng)用價(jià)值。

魚(yú)精蛋白常以DNA-蛋白質(zhì)的形態(tài)存在，其結(jié)合鍵不牢固，易斷開(kāi)，可用硫酸將其斷開(kāi)，制成魚(yú)精蛋白硫酸鹽，再用有機(jī)溶劑析出沉淀(李若綺等, 2014)。提取反應(yīng)過(guò)程：DNA-蛋白質(zhì)+H2SO4→硫酸魚(yú)精蛋白+DNA+H2O(吳燕燕等, 1999)。對(duì)DNA-核蛋白和RNA-核蛋白溶解度的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NaCl濃度為 0.14 mol/L時(shí)，DNA-核蛋白溶解度僅為水中溶解度的1%，而RNA-核蛋白有相當(dāng)大的溶解度，因此，選用0.14 mol/L NaCl來(lái)沉淀DNA-核蛋白(謝俊杰等, 2002)。因魚(yú)的種類(lèi)不同，提取得到的魚(yú)精蛋白也存在較大差異。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要從鮭魚(yú)()和鯡魚(yú)()的成熟精巢中提取魚(yú)精蛋白，而對(duì)河鲀()魚(yú)精蛋白的研究較少。河鲀，又名鲀、吹肚魚(yú)、氣泡魚(yú)等，屬硬骨魚(yú)綱、鲀形目、鲀科、東方鲀屬，主要分布在我國(guó)渤海、東海、黃海及江河下游，為近海與河川底層肉食性海產(chǎn)有毒魚(yú)類(lèi)(楊春等, 2003)。野生河鲀毒性較高，而人工養(yǎng)殖的河鲀基本無(wú)毒。中國(guó)河鲀資源豐富，據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)海水養(yǎng)殖河鲀產(chǎn)量約為23000 t，淡水養(yǎng)殖河鲀產(chǎn)量約為5000 t。暗紋東方鲀()是主要養(yǎng)殖種類(lèi)之一，主要養(yǎng)殖區(qū)域是江蘇、廣東和福建地區(qū)(張迪等, 2017)。江蘇地區(qū)主要為淡水養(yǎng)殖河鲀，產(chǎn)量約占全國(guó)總河鲀淡水養(yǎng)殖的68%。

本研究以暗紋東方鲀精巢為原料，采用酸法提取魚(yú)精蛋白，通過(guò)6個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)，探討硫酸濃度、硫酸用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)、提取溫度和95%乙醇用量對(duì)魚(yú)精蛋白提取的影響，并通過(guò)正交法優(yōu)化其提取工藝，得到最佳提取工藝條件，通過(guò)十二烷基硫酸鈉–聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)分析暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白的分子量，并對(duì)其氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定。本研究對(duì)河鲀精巢的高效利用具有重大意義，以期河鲀魚(yú)精蛋白可以更好地應(yīng)用在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

暗紋東方鲀精巢(2019年2月，冷凍運(yùn)輸)江蘇中洋集團(tuán)提供。

NaCl、95%乙醇、丙酮、乙醚和硫酸(均為分析純)，國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)染色液G-250、SDS-PAGE電泳液、BeyoGelTMSDS- PAGE預(yù)制膠(4%~20%)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；2×Protein Loading Buffer，天根生化科技(北京)有限公司；Real Band蛋白預(yù)染，美國(guó)Marker Bio Basic Inc (BBI)；蛋白定量測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；GL- 26M/MI立式高速冷凍離心機(jī)，上海趙迪生物科技有限公司；AUW320電子分析天平，日本島津公司；凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；UV-1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；氨基酸自動(dòng)分析儀L-8800，日本日立公司；LGJ-12冷凍干燥機(jī)，河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；DHG-9076A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TY-80A/S脫色搖床，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；DYCZ-24DN電泳槽、DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 將暗紋東方鲀精巢組織解凍后，用蒸餾水清洗干凈(主要去除附著的雜物，如結(jié)締組織、腺體、脂肪等)，瀝干水分，分裝在密封袋中(每袋約200 g)，–30℃冷藏備用。

1.3.2 原料基本營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定 水分測(cè)定參考(GB 5009.3-2016)《食品中水分的測(cè)定》中的直接干燥法；灰分測(cè)定參考(GB 5009.4-2016)《食品中灰分的測(cè)定》中的食品中總灰分的測(cè)定；蛋白質(zhì)測(cè)定參考(GB 5009.5-2016)《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法；脂肪測(cè)定參考(GB 5009.6-2016)《食品中脂肪的測(cè)定》中的索氏抽提法。

1.3.3 暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白提取工藝 工藝流程：解凍后的精巢組織→搗碎→勻漿→離心→棄上清液，沉淀重復(fù)操作1次→H2SO4溶液提取→離心→收集離心的上清液→過(guò)濾→冷乙醇沉淀→丙酮洗滌→乙醚洗滌→冷凍干燥→魚(yú)精蛋白粗品。

參照白嬋等(2018)和曹文紅等(2017)的方法稍作修改。稱(chēng)取100 g暗紋東方鲀精巢于組織搗碎機(jī)中，加入2倍體積0.14 mol/L的NaCl溶液，勻漿1 min，冰浴攪拌15 min，靜置15 min，于4℃、8000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀重復(fù)操作1次，收集沉淀，加入H2SO4，在一定溫度下提取一定時(shí)間，4℃、10000 r/min離心10 min，收集離心的上清液，過(guò)濾，濾液用一定體積的95%乙醇冰浴沉淀過(guò)夜后離心，所得沉淀用丙酮洗滌2次，乙醚洗滌1次，冷凍干燥即得暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白粗品。

1.3.4 硫酸提取法提取條件單因素實(shí)驗(yàn)

(1)硫酸濃度對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響

設(shè)定硫酸用量為3倍(ml/g)，提取溫度為(25±1)℃，提取時(shí)間為0.5 h，提取2次，95%乙醇用量為3倍(ml/g)，分別控制硫酸濃度為0.1、0.3、0.5、0.7和0.9 mol/L，探討硫酸濃度對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響。

(2)硫酸用量對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響

設(shè)定硫酸濃度為0.3 mol/L，提取溫度為(25±1)℃，提取時(shí)間為0.5 h，提取2次，95%乙醇用量為3倍(ml/g)，分別控制硫酸用量為1、2、3、4和5倍，探討硫酸用量對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響。

(3)提取次數(shù)對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響

設(shè)定硫酸濃度為0.3 mol/L，硫酸用量為3倍(ml/g)，提取溫度為(25±1)℃，提取時(shí)間為0.5 h，95%乙醇用量為3倍(ml/g)，分別控制提取次數(shù)為1、2、3、4和5次，探討提取次數(shù)對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響。

(4)提取時(shí)間對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響

設(shè)定硫酸濃度為0.3 mol/L，硫酸用量為3倍(ml/g)，提取溫度為(25±1)℃，提取2次，95%乙醇用量為3倍(ml/g)，分別控制提取時(shí)間為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h，探討提取時(shí)間對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響。

(5)提取溫度對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響

設(shè)定硫酸濃度為0.3 mol/L，硫酸用量為3倍(ml/g)，提取時(shí)間為0.5 h，提取2次，95%乙醇用量為3倍(ml/g)，分別控制提取溫度為10℃、20℃、30℃、40℃和50℃，探討提取溫度對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響。

(6) 95%乙醇用量對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響

設(shè)定硫酸濃度為0.3 mol/L，硫酸用量為3倍(ml/g)，提取溫度為(25±1)℃，提取時(shí)間為0.5 h，提取2次，分別控制95%乙醇用量為1、2、3、4和 5倍，探討95%乙醇用量對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響。

1.3.5 硫酸提取法正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇硫酸濃度、硫酸用量、提取次數(shù)和95%乙醇用量進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，以確定暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白的最佳提取工藝條件，實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 L9(34)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白提取工藝正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

Tab.1 Factors and their levels used in L9(34 ) orthogonal design of the extraction of T. obscurus protamine experiments

1.3.6 暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg提取的粗魚(yú)精蛋白，用生理鹽水定容至10 ml，配制成1 mg/ml的蛋白溶液。再用蛋白定量試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

蛋白質(zhì)提取率按公式(1)計(jì)算：

式中，1為暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率(%)，1為蛋白質(zhì)量(g)，0為暗紋東方鲀精巢質(zhì)量(g)。

1.3.7 暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

采用十二烷基硫酸鈉–聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)對(duì)提取的暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白進(jìn)行分析，以確定該魚(yú)精蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量。100 v恒壓電泳約100 min，至溴酚藍(lán)遷移至距凝膠下端約1 cm處，停止電泳，取出凝膠，用考馬斯亮藍(lán)染色液染色30 min，再用脫色液脫色至背景褪色、條帶清晰可見(jiàn)(Compton, 1985; Sedmak, 1977; Sch?gger, 2006)。測(cè)量遷移距離，計(jì)算相對(duì)遷移率(f)(徐明生等, 2004)。

1.3.8 暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白的氨基酸組成 采用GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測(cè)定方法》進(jìn)行樣品前處理。

氨基酸自動(dòng)分析儀條件：色譜柱(4.6 mm I.D.×60.0 mm)；分離樹(shù)脂：陽(yáng)離子交換樹(shù)脂；柱溫度： 57℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：570 nm(脯氨酸440 nm)；1通道緩沖溶液流速：0.40 ml/min；反應(yīng)液：茚三酮試劑；2通道反應(yīng)液流速：0.35 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所測(cè)結(jié)果為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，采用Origin 8.5軟件進(jìn)行作圖，SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 暗紋東方鲀精巢基本成分

暗紋東方鲀精巢的營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表2。從表2可以看出，含水量較高，達(dá)80.22%；其次是粗蛋白，占濕重的的14.66%；脂肪含量較低，僅占濕重的1.73%。通過(guò)計(jì)算，粗蛋白占暗紋東方鲀精巢干重的74.12%，脂肪占8.75%，說(shuō)明暗紋東方鲀精巢是富含蛋白質(zhì)，而脂肪含量很低的產(chǎn)品，與胡曉璐等(2013)研究的魷魚(yú)精巢組織基本成分的結(jié)論一致。

表2 暗紋東方鲀精巢的基本成分

注: 各組分含量按濕重計(jì)

Note: The content of every composition was counted on wet weight

2.2 暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 硫酸濃度對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響

硫酸濃度對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響見(jiàn)圖1。低濃度的硫酸對(duì)魚(yú)精蛋白提取不完全，硫酸與魚(yú)精蛋白結(jié)合較少，生成的魚(yú)精蛋白硫酸鹽較少，得率較低，適當(dāng)提高硫酸濃度，可幫助拆分核酸與目標(biāo)蛋白之間的鍵，提高目標(biāo)蛋白得率，當(dāng)濃度達(dá)到 0.3 mol/L時(shí)，蛋白的提取接近飽和，得率為3.51%，出現(xiàn)峰值后，得率會(huì)隨濃度的增大而降低，此時(shí)，高濃度的硫酸會(huì)使蛋白質(zhì)暴露出更多的疏水基團(tuán)(Omana, 2010)，從而破壞蛋白結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)可能被部分水解，降低了魚(yú)精蛋白的含量。該結(jié)果與劉淑集等(2019)的研究一致，均表現(xiàn)出相對(duì)較高濃度的硫酸會(huì)使魚(yú)精蛋白的得率下降。從圖1中還可以看出，暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白受硫酸濃度影響明顯，所以選擇硫酸濃度值為0.3 mol/L為最適宜條件。

2.2.2 硫酸用量對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響

硫酸用量對(duì)得率的影響見(jiàn)圖2。硫酸用量從1 ml/g (體積與質(zhì)量比，下同)增加到5 ml/g時(shí)，魚(yú)精蛋白得率呈先升高、后降低，最后趨于平穩(wěn)的變化趨勢(shì)。當(dāng)硫酸用量較少時(shí)，體系過(guò)小而導(dǎo)致魚(yú)精蛋白溶解不完全，適當(dāng)增加硫酸提取液有助于魚(yú)精蛋白溶出，當(dāng)硫酸用量為3 ml/g時(shí)，魚(yú)精蛋白得率最高，蛋白質(zhì)溶出達(dá)到飽和，繼續(xù)增加硫酸用量，魚(yú)精蛋白得率出現(xiàn)小幅度降低，主要是因?yàn)樘崛∫后w積過(guò)大，增加了操作體系的整體規(guī)模，也增大操了作過(guò)程中的損失率，因而對(duì)得率產(chǎn)生負(fù)面影響。故使得蛋白得率最大化的最佳硫酸用量為3 ml/g。

圖2 硫酸用量對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率影響

2.2.3 提取次數(shù)對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響

提取次數(shù)對(duì)魚(yú)精蛋白得率的影響見(jiàn)圖3。暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白經(jīng)過(guò)2次提取后，繼續(xù)增加提取次數(shù)時(shí)，得率反而降低，說(shuō)明殘?jiān)锌商崛〉聂~(yú)精蛋白在第2次基本被提取完全，繼續(xù)重復(fù)提取只會(huì)增加操作過(guò)程中的損失，降低魚(yú)精蛋白得率。因此，提取次數(shù)2次為最佳。

圖3 提取次數(shù)對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響

提取時(shí)間對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響見(jiàn)圖4。隨著提取時(shí)間從0.5 h延長(zhǎng)到2.5 h，暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率整體呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明延長(zhǎng)提取時(shí)間不能提高魚(yú)精蛋白的得率。從加入硫酸開(kāi)始提取計(jì)時(shí)，0.5 h前，硫酸會(huì)輔助魚(yú)精蛋白與核酸之間的鍵斷開(kāi)，隨著時(shí)間的增加，得率逐漸降低，可能是因?yàn)橹氨环蛛x出來(lái)的魚(yú)精蛋白被酸水解，因此，絕大多數(shù)的精蛋白都在0.5 h內(nèi)被提取出來(lái)。綜合來(lái)看，0.5 h時(shí)，魚(yú)精蛋白溶解量與損失量差值達(dá)到最大化，得率較高，提取較為充分，故選取提取時(shí)間為0.5 h比較合適。

2.2.5 提取溫度對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響

提取溫度對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響見(jiàn)圖5。溫度較低時(shí)，對(duì)魚(yú)精蛋白得率產(chǎn)生副作用，當(dāng)溫度從10℃升高到50℃時(shí)，魚(yú)精蛋白得率呈現(xiàn)先升高后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。因?yàn)檫m當(dāng)升高溫度可使分子的運(yùn)動(dòng)速度加快，提高了蛋白的溶出率(洪晶等，2013)。繼續(xù)增加溫度，魚(yú)精蛋白得率沒(méi)有明顯升高，而是在此基礎(chǔ)上浮動(dòng)，說(shuō)明該魚(yú)精蛋白的耐熱性較好，不易受溫度的影響而變性?？傮w來(lái)看，溫度對(duì)河鲀魚(yú)精蛋白的提取率影響并不大，提取得到的蛋白均為白色，因此，在簡(jiǎn)化提取條件和節(jié)約操作成本的角度考慮，選取室溫提取比較好。

2.2.6 95%乙醇用量對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響 乙醇用量對(duì)魚(yú)精蛋白得率的影響見(jiàn)圖6。隨著乙醇用量的增大，暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率呈先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)，用量3倍時(shí)，得率達(dá)到最高點(diǎn)，繼續(xù)增加乙醇用量，魚(yú)精蛋白得率呈緩慢下降趨勢(shì)，可能是乙醇用量過(guò)大，破壞了蛋白的結(jié)構(gòu)，影響得率。因此，最佳用量為3 ml/g。

圖5 提取溫度對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的影響

圖6 乙醇用量對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率影響

2.3 暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白提取工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別以硫酸濃度、硫酸用量、提取次數(shù)和95%乙醇用量為考察因素，以暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按L9(34)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化最佳提取條件，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，在9個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)組中，第4組的提取效果最好，蛋白得率達(dá)到3.04%；其次為第2組，蛋白得率達(dá)到3.01%；由極差分析可知，影響暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的因素主次為：C>B>A>D，即提取次數(shù)>硫酸用量>硫酸濃度>95%乙醇用量。暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白提取最優(yōu)工藝組合為A1B1C2D1，即硫酸濃度為0.2 mol/L、硫酸用量為2.5倍、提取次數(shù)為2次、冷乙醇用量為2.5倍。該工藝條件下提取的魚(yú)精蛋白得率可達(dá)3.82%，高于各實(shí)驗(yàn)組中暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白的得率。

表3 L9(34)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.3 L9(34) orthogonal result of the extraction of T. obscurus protamine

由表4可知，校正模型具有顯著性，其中，硫酸濃度(A)、硫酸用量(B)對(duì)提取率的影響(<0.05)，提取次數(shù)(C)對(duì)提取率的影響(<0.01)，95%乙醇用量(D)對(duì)提取率的影響(>0.05)，依次對(duì)應(yīng)與蛋白得率的關(guān)系依次為顯著、顯著、極顯著和不顯著。四者在暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白提取過(guò)程中需重點(diǎn)控制的順序?yàn)椋禾崛〈螖?shù)>硫酸用量>硫酸濃度>95%乙醇用量。

表4 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

Tab.4 Analysis of variance of the experimental results of orthogonal array design

*：差異顯著，<0.05；**：差異極顯著，<0.01

*: The difference is significant,< 0.05; **: The difference is highly significant,<0.01

2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

利用十二烷基硫酸鈉–聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)確定暗紋東方鲀精巢中抗菌活性蛋白的相對(duì)分子量及分析其成分組成見(jiàn)圖7。由圖7可知，所提取的暗紋東方鲀精巢組織中的抗菌活性蛋白組分由2個(gè)條帶組成，主體成分相對(duì)分子量在17~ 25 kDa之間。經(jīng)計(jì)算，暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白2條區(qū)帶的相對(duì)遷移率(f)分別為0.7814和0.8772。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，相對(duì)遷移率(f)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行直線回歸分析(圖8)，回歸系數(shù)2=0.9934，回歸方程為=–1.1073+2.2321。暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白的分子量分別為23.27和18.23 kDa。在相關(guān)魚(yú)類(lèi)精巢抗菌活性蛋白的研究中，此抗菌活性蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量大于徐明生等(2004)測(cè)得鯉魚(yú)()抗菌魚(yú)精蛋白純品的分子量(15.32 kDa)。本研究提取的暗紋東方鲀粗魚(yú)精蛋白有2個(gè)條帶，分析其原因主要有2點(diǎn)，一是樣品中含有其他雜蛋白，二是該蛋白質(zhì)分子具有幾個(gè)亞基。也有研究表明，魚(yú)類(lèi)精巢抗菌活性蛋白組分并不單一，它是由互相類(lèi)似的數(shù)種成分組成。

圖7 暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白Tricine-SDS-PAEG電泳

M：預(yù)染蛋白Marker；A：暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白

M: Pre-stained protein marker; A:protamine

圖8 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白的氨基酸組成

暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白的氨基酸組成見(jiàn)表5，從 表5中可以看出，丙氨酸和精氨酸是是該魚(yú)精蛋白的主要氨基酸，相對(duì)含量分別為17.39%和31.40%，約占總氨基酸的50%。這與劉紅玉等(2007)研究的大馬哈魚(yú)()的氨基酸組成較為類(lèi)似，均含有較高的精氨酸。堿性氨基酸(精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸)占31.87%，與鰱魚(yú)()中堿性氨基酸含量相近(謝俊杰等, 2001)。但與俞加林(1994)文中提到的精氨酸占2/3以上的結(jié)果有明顯差別。分析其原因可能是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，人工養(yǎng)殖的河鲀由于食物、地理位置和環(huán)境等差異，導(dǎo)致目前河鲀精巢的氨基酸組成與過(guò)去有所差異。根據(jù)氨基酸的組成和種類(lèi)，可將魚(yú)精蛋白分為3類(lèi)，分別是單魚(yú)精蛋白、雙魚(yú)精蛋白和三魚(yú)精蛋白。因暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白含有精氨酸和組氨酸，所以屬于雙魚(yú)精蛋白。

表5 暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白氨基酸組成分析

Tab.5 Amino acid composition analysis of T. obscurus protamine

*：必需氨基酸；–：未檢測(cè)到

*: Essential amino acid; – : Not detected

3 結(jié)論

本研究采用硫酸提取法提取暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化得到最佳提取工藝：硫酸濃度為0.2 mol/L、硫酸用量為2.5倍、提取次數(shù)為2次、冷乙醇用量為2.5倍。影響暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白得率的因素主次為：提取次數(shù)>硫酸用量>硫酸濃度>95%乙醇用量。溫度對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白的得率影響較小，說(shuō)明暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白具有很好的耐熱性。在最佳提取工藝條件下，暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白的得率最大為3.82%。由Tricine-SDS-PAGE電泳可知，魚(yú)精蛋白的分子量較小，粗提法得到的魚(yú)精蛋白經(jīng)電泳后出現(xiàn)2個(gè)條帶，說(shuō)明該粗魚(yú)精蛋白雜質(zhì)較少。經(jīng)計(jì)算，暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白的分子量分別為23.27和 18.23 kDa。丙氨酸和精氨酸是是該魚(yú)精蛋白的主要氨基酸，相對(duì)含量分別為17.39%和31.40%，約占總氨基酸的50%。根據(jù)氨基酸的組成種類(lèi)和數(shù)量來(lái)分，暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白屬于雙魚(yú)精蛋白。該研究為河鲀魚(yú)精蛋白的高效利用奠定理論基礎(chǔ)。接下來(lái)可對(duì)該魚(yú)精蛋白的理化特性進(jìn)一步研究。

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Optimization of Extraction Process of Protamine from

ZHANG Jiayuan1,2, ZHANG Hongcai1,2, CHEN Shunsheng1,2①

(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306;2. National Research and Development Branch Center for Freshwater Aquatic Products Processing Technology (Shanghai),National Experimental Teaching Demonstration Center of Food Science and Engineering (Shanghai Ocean University), Shanghai 201306)

The fish's testis, commonly known as fish white, is often discarded as waste owing to its specific odor and is one of the by-products of fish processing. A basic protein, protamine, can be extracted from the testis of fish. Protamine has the advantages of high safety, good antibacterial performance, and high thermal stability. It can be used as an antibacterial ingredient in some foods in the field of food preservation. It has obvious antibacterial activity under alkaline conditions and is a promising antibacterial agent. Here, the testis ofwas used as the raw material, and the protamine was extracted by acid extraction. The extraction coefficient was used to determine the optimal extraction parameters. According to the results of orthogonal test, the importance factors of the extraction of protamine are as follows: extraction times > sulfuric acid dosage > sulfuric acid concentration>95% ethanol; optimal extraction conditions are: sulfuric acid concentration 0.2 mol/L, sulfuric acid dosage is 2.5 times, the number of extractions was 2, and the amount of 95% ethanol was 2.5 times. Under this condition, the extraction rate of protamine fromwas 3.82%, and the protein content was 89.01%. According to the tricine-SDS-PAGE, the extracted crude protamine has two bands with molecular weights of 25 kDa and 20 kDa, respectively. Analysis of its lytic acid composition found that arginine and alanine content were relatively higher, accounting for 31.40% and 17.39%, respectively. This study is of great significance for the efficient use of testes of puffer-fish (dark-spotted oriental carp), and also lays a theoretical foundation for the application of stag beetle (dark-spotted oriental carp) protamine in the food and pharmaceutical fields.

; Protamine; Extraction; Process optimization

CHEN Shunsheng, E-mail: sschen@shou.edu.cn

TS254.4

A

2095-9869(2020)05-0020-09

10.19663/j.issn2095-9869.20190810001

http://www.yykxjz.cn/

張家源, 張洪才, 陳舜勝. 暗紋東方鲀魚(yú)精蛋白的提取工藝優(yōu)化研究. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(5): 168–176

Zhang JY, Zhang HC, Chen SS. Optimization of extraction process of protamine from. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(5): 168–176

* 國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31471685)和上海市高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái)項(xiàng)目(ZF1206)共同資助[The work was supported by National Natural Science Foundation of China (31471685), and Shanghai University Knowledge Service Platform Project (ZF1206)]. 張家源，E-mail: JYZhangshou@163.com

陳舜勝，教授，E-mail: sschen@shou.edu.cn

2019-08-10,

2019-08-30

(編輯 陳 輝)