骨髓間充質(zhì)干細胞對樹脂毒素介導(dǎo)的小鼠神經(jīng)病理性疼痛模型鎮(zhèn)痛作用及其機制*

李楠琦 徐雯雯 湯 洋 安 珂 萬 麗

（1 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣州 510080；2 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院疼痛科，廣州510260）

神經(jīng)病理性疼痛 (neuropathic pain, NP) 為外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)損傷或者功能紊亂所引起的疼痛。臨床上大多數(shù)神經(jīng)病理性疼痛缺乏有效治療方法，病人長期疼痛狀態(tài)導(dǎo)致機體內(nèi)環(huán)境紊亂、精神抑郁、甚至產(chǎn)生自殺的行為。膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的重要支持細胞，近年來，大量的實驗證據(jù)證明膠質(zhì)細胞的活化在慢性疼痛的產(chǎn)生及痛覺中樞敏化中起重要作用。干預(yù)、逆轉(zhuǎn)痛覺超敏狀態(tài)，尤其是中樞水平的痛覺敏化，探究難治性神經(jīng)病理性疼痛新的治療方法是目前疼痛轉(zhuǎn)化研究急待解決的問題[1]。骨髓間充質(zhì)干細胞 (bone mesenchymal stem cells, BMSC)，為骨髓分離出的一類具有多向分化潛能的干細胞[2]，近年來干細胞治療也成為國家重點支持的治療技術(shù)與研究方向。目前較多基礎(chǔ)研究焦點關(guān)注原位移植BMSC 對損傷的修復(fù)作用[3]，但其通過靜脈注射發(fā)揮免疫調(diào)控及治療神經(jīng)病理性疼痛的機制仍待進一步探究。本研究通過樹脂毒素 (resniferatoxin, RTX) 介導(dǎo)的新型神經(jīng)病理性疼痛小鼠模型，證實了小膠質(zhì)細胞參與疼痛中樞敏化的形成，并首次發(fā)現(xiàn)了靜脈注射BMSC 可抑制小膠質(zhì)細胞活化，BMSC 可通過改善脊髓背角樹突棘的形態(tài)轉(zhuǎn)化改善痛覺過敏的機制，為臨床神經(jīng)病理性疼痛提供更為理想的治療方法。

方 法

1. 實驗動物

健康雄性C57/BL6 小鼠36 只，6～8 周齡，質(zhì)量22～25 g，均為SPF級，購自廣東省實驗動物中心。實驗過程中對動物處置參照國家科學(xué)技術(shù)部2006發(fā)布的《關(guān)于善待動物的指導(dǎo)性意見》的相關(guān)要求[4]。

2. 主要試劑及儀器

vonFrey 纖毛儀購自美國Stoelin 公司，C57/BL6來源的GFP-BMSC 購自Cyagen Biosciences 廣州公司；DMEM 低糖培養(yǎng)基、胎牛血清Fetal Bovine Serum (FBS)、0.25%胰蛋白酶、二甲基亞砜購自Gibco 美國公司；CD11b 兔抗小鼠抗體、MAPK p38 鼠單克隆抗體，Alex488 羊抗兔，Cy3 羊抗鼠二抗購自Abcam 公司。HRP 山羊抗兔二抗購自武漢Proteintech 公 司；FD Rapid GolgiStainTM Kit FD 快速高爾基染色試劑盒購自美國ThermoFisher Scientific公司；Western blot 電泳、轉(zhuǎn)膜儀購自Bio-Rad 公司，熒光倒置顯微鏡購自日本Leica 公司。

3. 動物模型的建立及分組

恒溫清潔環(huán)境，光照12 h，濕度50%，予充足飲水及食物，每3 天更換墊料，飼養(yǎng)1 周后隨機分為3 組，每組12 只：①溶劑對照組（Control 組）：一次性腹腔注射200 μl 溶解樹脂毒素所用溶劑10%酒精10%吐溫80；②RTX 神經(jīng)痛組（RTX 組）：腹腔注射樹脂毒素100 μg/kg，溶解于10%酒精加10%吐溫80 溶液中，即每只造模劑量為4 μg。注射RTX 后第5 天注射200 μl PBS；③骨髓間充質(zhì)干細胞移植組（BMSC 組）：RTX 神經(jīng)痛建立后5 天，每只小鼠單次尾靜脈輸注包含骨髓間充質(zhì)干細胞1×106個的200 μl 細胞懸液。每組小鼠行為學(xué)取5只進行作圖統(tǒng)計。細胞移植劑量的選取根據(jù)為文獻[5]以及預(yù)實驗。小鼠尾靜脈注射使用1 ml 刻度胰島素注射針。各組小鼠在手術(shù)后第30 天統(tǒng)一處理、取材，并進行各指標(biāo)的檢測。

4. 行為學(xué)測試

機械痛閾 (mechanical withdrawl threshold, MWT)測試時間固定于10:00～12:00 進行，測試前30 min將小鼠置于玻璃箱中適應(yīng)環(huán)境。采用vonFrey filaments測試，使用0.07 g～2 g 范圍的纖維絲對小鼠右后足底進行MWT 測定，從0.07 g 纖維絲開始，刺激小鼠右后足底使纖毛稍彎曲呈S 形，持續(xù)時間≤5 s，小鼠出現(xiàn)舔足或足縮回的數(shù)值記為陽性反應(yīng)。若5 次測定中陽性反應(yīng)不足3 次則給予相鄰大一級強度纖維絲的刺激[6]。兩次刺激之間至少間隔15 s。將出現(xiàn)3 次以上陽性反應(yīng)的最小纖維強度定為小鼠的MWT。每只小鼠測試5 次取MWT 平均值，每組統(tǒng)計5只小鼠。于RTX注射前1天測試基線值作自身對照，以及注射RTX 注射后1、5、10、15、20、25、30 天測試小鼠右足底對機械刺激的反應(yīng)。Hargreaves 熱痛閾 (thermal withdrawal latency, TWL) 與MWT 測試間隔1 h，小鼠置于Hargreaves 熱痛儀透明玻璃板上，使用紅外光斑照射右足，記錄出現(xiàn)縮足反應(yīng)時間，cut-off 時間設(shè)置為20 s 避免小鼠足底損傷。

5. GFP-骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)、擴增

取內(nèi)含1×106BMSC 的凍存細胞復(fù)蘇，接種于T25 培養(yǎng)瓶中，于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清的L-DMEM完全培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)基。2 天后細胞鋪滿瓶底約90%，加入0.25%胰酶2 ml 消化2～3 min，800 rpm，離心半徑12 cm，離心5 min，按1:2 比例傳代。細胞傳至第8 代后用胰酶消化后離心，細胞計數(shù)板計數(shù)后取1×106BMSCs 重懸于200 μl PBS 中，于RTX 注射第5 天，用1 ml 胰島素注射器給小鼠尾靜脈注射細胞，RTX 模型組注射200 μl 0.1 M PBS。

6. 組織切片與染色

RTX 模型建立30 天后，每組小鼠于氯胺酮聯(lián)合咪達唑侖深麻醉下，開胸暴露心臟，以0.1 M PBS 從左心灌流沖凈血液后以4%多聚甲醛灌注固定，取腰段L2-L5脊髓組織，每組6 只，4%多聚甲醛后固定48 h，30%蔗糖溶液脫水沉底后，以O(shè)CT包埋于冰凍切片機作25 μm 連續(xù)冠狀切片，進行免疫熒光染色觀察。主要觀察指標(biāo)：觀察3 組小鼠脊髓背角CD11b 標(biāo)記的小膠質(zhì)細胞形態(tài)及激活情況，GFP 染色觀察BMSC 歸巢情況。免疫熒光染色步驟：冰凍切片用0.1 M PBS 振蕩清洗后加入3%山羊血清和0.3% Triton100X 的封閉液室溫封閉2 h，加入一抗GFP (1:400)，CD11b (1:400)， p38 MAPK (1:200) 后4℃孵育過夜，吸凈一抗后加入0.1 M PBS 清洗10 min×3 次，滴加熒光二抗工作液Alex488 (1:600)，Cy3 (1:1000)室溫孵育2 h，0.1 M PBS 振蕩沖清洗10 min×3 次，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長為 550/565 nm 的Cy3 呈紅色熒光表示，激發(fā)波長為488 nm 的Alex488 熒光顯示為綠色，兩受體共存表達處顯示黃色熒光。

7. 免疫印跡檢測小鼠腰段脊髓p38 蛋白的表達情況

RTX 模型建立30 天后，使用RIPA 蛋白提取液提取3 組小鼠L2-L5脊髓總蛋白，每組3 只。取出小鼠脊髓后以液氮速凍，然后在冰上使用研磨器及超聲破碎組織，使用二喹啉酸 (bicinchoninic acid, BCA) 蛋白定量試劑盒對提取的蛋白進行定量。各組取30 μg 等量總蛋白在12% SDS-PAGE 上電泳（電壓 80 V 20 min，120 V 1 h），之后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，300 mA 轉(zhuǎn)模2 h。5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，一抗分別為GAPDH (1:10 000)， p38 MAPK (1:2000) 用辣根過氧化物酶 (HRP) 共軛的二抗室溫孵育2 h，ECL 顯影劑顯影曝光。

8.高爾基染色

RTX 模型建立30 天后，每組小鼠在氯胺酮混合咪達唑侖麻醉液（100 mg/kg 氯胺酮 + 50 mg/kg咪達唑侖）深麻醉下處死小鼠后取出腰段脊髓，每組取材3 只。用蒸餾水沖凈表面血液，在冰凍震蕩切片機上將脊髓切成10 mm 的小塊，根據(jù)Ramón Moliner, Glaser 和Van der Loos 所闡述的方法原理設(shè)計的FD Rapid GolgiStainTM Kit（FD 快速高爾基染色試劑盒）操作指導(dǎo)進行染色，統(tǒng)計每組小鼠脊髓背角淺層的至少三個獨立神經(jīng)元的完整樹突上蘑菇形態(tài)樹突棘密度。

9. 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采集、統(tǒng)計及繪圖分別使用 Excel、SPSS和Graphpad Prism 7.0 軟件進行；行為學(xué)測試結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±SEM)表示。對于各組行為學(xué)痛閾值和免疫熒光陽性細胞數(shù)、免疫印跡灰度值比較采用單因素重復(fù)測量方差分析(One-way Repeated measurement ANOVA)并對同一時間點進 行組間比較，P＜ 0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1. GFP-BMSC 的培養(yǎng)純化

培養(yǎng)純化的第8 代骨髓間充質(zhì)干細胞聚集度80%，1×106密度，在倒置像差顯微鏡下，呈簇狀分布的梭形細胞聚集，GFP 標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細胞在熒光顯微鏡下以488 nm光激發(fā)，細胞輪廓清晰，胞膜完整，細胞呈綠色（見圖1A）。成脂誘導(dǎo)分化細胞貼壁 100%匯合后，加入間質(zhì)干細胞成脂誘導(dǎo)液，成脂誘導(dǎo) 7 天后，細胞內(nèi)有小脂滴出現(xiàn)，約13 天后脂滴數(shù)量增加并相互融合，細胞由長梭形變?yōu)閳A形或多邊形，油紅O 染色顯示有大量脂質(zhì)沉淀（見圖1B）。成骨誘導(dǎo)分化細胞貼壁約70%匯合后，加入間質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)培養(yǎng) 15 天，胞質(zhì)內(nèi)充滿顆粒，細胞呈集落樣生長，細胞間可見鈣質(zhì)沉積，細胞結(jié)節(jié)中心的細胞逐漸融合失去細胞結(jié)構(gòu)，鈣結(jié)節(jié)形成明顯，經(jīng)茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)（見圖1C）。

2. 小鼠行為學(xué)分析

每組統(tǒng)計5 只小鼠，RTX 組MWT 在第5 天開始下降，第10 天與溶劑對照組有顯著性差異 (P＜ 0.05)，且持續(xù)至RTX 給藥后30 天。機械異常疼痛的改變提示RTX 誘導(dǎo)神經(jīng)性疼痛模型建立成功（見圖2A）。BMSC 組于RTX 注射后第10 天 MWT開始升高，至第25 天即BMSC 注射后20 天與RTX 組差異有顯著性并持續(xù)至第30 天（P＜ 0.05，見圖2B）。對照組小鼠與RTX 模型組小鼠TWL無顯著性差異。

3. 熒光顯微鏡觀察骨髓間充質(zhì)干細胞標(biāo)記情況

在RTX 模型第30 天，GFP 抗體染色的BMSC注射組小鼠腰段脊髓有綠色陽性細胞，細胞輪廓清晰，DAPI 染色疊片顯示完整細胞核，且綠色熒光細胞大部分位于脊髓背角淺層，說明BMSC 定向歸巢至小鼠脊髓背角（見圖3）。

4. 對RTX 注射30 天后取材小鼠腰段脊髓進行熒光染色

在熒光顯微鏡下，小膠質(zhì)細胞標(biāo)記物CD11b顯示紅色熒光，小膠質(zhì)細胞胞體明顯，RTX 組較對照組CD11b 陽性明顯增加（P＜ 0.05，見圖4A 和圖5），胞體肥大且突觸增粗，呈阿米巴樣活化形態(tài)， BMSC 治療組CD11b 陽性表達較RTX 組顯著減少，（P＜ 0.01，見圖4D 和圖5）；免疫印跡法檢測3 組小鼠脊髓p38 MAPK 蛋白表達，RTX 組p38 MAPK蛋白表達明顯上調(diào)，BMSC 注射組p38 MAPK表達下調(diào)（P＜ 0.05，見圖4C、4D 和圖5）；Western blot 結(jié)果顯示RTX 組小鼠脊髓MAPK p38 MAPK 蛋白表達顯著上調(diào)，而BMSC 移植組p38 MAPK 表達降低（見圖4B 和4C）；小膠質(zhì)細胞標(biāo)記物CD11b與p38 MAPK 雙染顯示，在RTX 組p38 MAPK 與小膠質(zhì)細胞有高度共定位，且RTX 組p38 MAPK與CD11b 雙染陽性細胞與對照組相比增多，而在BMSC 組降低（見圖5）。

5. 通過對腰段脊髓的高爾基染色觀察每組小鼠突觸形態(tài)學(xué)變化

RTX 組樹突上頭寬大于頸長的蘑菇形態(tài)樣樹突棘明顯增多（見圖6）。提示蘑菇形態(tài)樹突棘的形成與疼痛密切相關(guān)[7]。統(tǒng)計每組小鼠脊髓背角神經(jīng)元樹突上蘑菇形態(tài)樹突棘密度發(fā)現(xiàn)，與對照組相比RTX 組蘑菇型樹突棘密度增加 (P＜ 0.05)， BMSC組蘑菇形態(tài)樹突棘密度較RTX 組降低 (P＜ 0.05)。

討 論

樹脂毒素 (resiniferatoxin) 為辣椒素類似物的超強毒素軛合物、TRPV1 的激動劑、可導(dǎo)致無髓鞘的C 類神經(jīng)纖維喪失，損傷有髓鞘Aδ 神經(jīng)纖維，RTX 介導(dǎo)的疼痛模型可使大鼠機械痛覺過敏，并介導(dǎo)脊髓背角P 物質(zhì)、CGRP 致痛神經(jīng)肽的釋放。臨床上帶狀皰疹后神經(jīng)痛的病人可呈現(xiàn)機械性感覺異常，大多數(shù)病人患區(qū)皮膚有痛覺超敏，而熱敏感度減退。有研究指出帶狀皰疹病人外周神經(jīng)的出芽變性，軸突缺失的病變與RTX 誘導(dǎo)的病理神經(jīng)性疼痛模型病理表現(xiàn)相似[8]，其造成的機械痛覺超敏也較為貼近帶狀皰疹后神經(jīng)痛的臨床表現(xiàn)。因此，本研究選擇RTX 模型小鼠作為研究對象，探究神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下小膠質(zhì)細胞的激活與痛敏的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，RTX 處理小鼠出現(xiàn)顯著的機械痛覺過敏現(xiàn)象，低機械痛閾可維持至第30 天，但注射RTX后熱痛閾與對照組相比差異無顯著性；同時脊髓小膠質(zhì)細胞活性明顯增強，說明小膠質(zhì)細胞的激活與RTX 誘導(dǎo)的機械痛敏密切相關(guān)，與Lei 等[9]的研究結(jié)果一致。

作為神經(jīng)系統(tǒng)的吞噬細胞，小膠質(zhì)細胞在損傷后不僅介導(dǎo)炎性介質(zhì)釋放，且是造成神經(jīng)鞘膜脫髓鞘病變的重要致病機制[10]。近年來的研究支持膠質(zhì)細胞活化引起疼痛敏化的觀點，當(dāng)機體受到傷害性刺激時，小膠質(zhì)細胞由靜息表型轉(zhuǎn)化為活化表型，激活一系列疼痛相關(guān)性通路以及炎癥因子的釋放，導(dǎo)致疼痛的中樞敏化和疼信號的級聯(lián)放大[11,12]。有研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細胞的拮抗劑雖然具有鎮(zhèn)痛作用，如非選擇性拮抗劑米諾環(huán)素 (minocyline) ，以及星狀神經(jīng)細胞拮抗劑氟代檸檬酸 (fluorocitra) ，但這兩者的鎮(zhèn)痛作用持續(xù)時間短暫，不僅對已經(jīng)形成的遲發(fā)神經(jīng)病理性疼痛作用有限，而且對損傷的神經(jīng)鞘膜無修復(fù)作用，并具有一定程度的神經(jīng)毒性[13]。因此早期修復(fù)損傷的軸突，控制小膠質(zhì)細胞的激活，可能為修復(fù)損傷的神經(jīng)鞘膜帶來契機。

干細胞治療是近年來用于神經(jīng)病理性疼痛的新方法，既往研究焦點為干細胞通過分化為損傷部位同類細胞，替代正常細胞所需的功能達到修復(fù)作用，但最近的研究更關(guān)注于干細胞通過旁分泌機制調(diào)節(jié)機體免疫微環(huán)境的能力，其特有的免疫抑制及調(diào)節(jié)能力可促使M1 促炎型膠質(zhì)細胞向M2 抗炎膠質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化[14]，從而抑制炎癥反應(yīng)及緩解疼痛。骨髓間充質(zhì)干細胞作為研究較多的干細胞，其具有自我更新、多向分化潛能的特點。體外實驗證明，骨髓間充質(zhì)干細胞與小膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)，可以抑制TNF-α刺激后的小膠質(zhì)細胞的激活[15]。但以往的細胞治療研究側(cè)重于原位移植骨髓間質(zhì)干細胞于損傷部位，通過BMSC 自分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF 產(chǎn)生神經(jīng)修復(fù)作用[16]。而本研究則是通過全身作用的方式對BMSC在神經(jīng)病理性疼痛的修復(fù)機制進行了探討。

由于疼痛中樞敏化在外周神經(jīng)及中樞水平廣泛存在，因此本研究中采用尾靜脈注射的方式，直接干預(yù)痛覺敏化的外周及中樞各階段，觀察BMSC的全身效應(yīng)。根據(jù)前期預(yù)實驗及相關(guān)文獻，選擇1×106作為小鼠細胞注射數(shù)量[5]。研究發(fā)現(xiàn)，尾靜脈注射BMSC 后第10 天開始小鼠MWT 開始升高，但與RTX 組對比無顯著性差異，直至BMSC 注射后第20 天，BMSC 組小鼠痛閾升高與對照組相比才具有顯著差異，說明BMSC 在遷移至炎癥部位前，在外周發(fā)揮有限的免疫調(diào)節(jié)作用。既往通過尾靜脈注射直接觀察到骨髓間充質(zhì)干細胞歸巢的研究并不多，有學(xué)者研究認(rèn)為，經(jīng)過尾靜脈注射的干細胞大多嵌頓于肺，需耗時約2 周才能從肺遷移到損傷部位，且遷移至損傷部位的細胞數(shù)量少[17]。本研究中觀察到，BMSC 經(jīng)尾靜脈注射后20 天，BMSC 對RTX處理小鼠產(chǎn)生明顯的抗痛敏作用，提示經(jīng)尾靜脈注射，BMSC 可遷移至損傷部位，且可通過調(diào)節(jié)脊髓背角突觸可塑性，對已經(jīng)形成的慢性神經(jīng)病理性疼痛發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。此外，相較于原位移植，靜脈注射干細胞侵入性損傷更小，操作較為簡便。雖然本研究對細胞遷移現(xiàn)象有所觀察，但對于促進這種現(xiàn)象發(fā)生涉及的趨化因子及遷移到脊髓的干細胞的轉(zhuǎn)歸還需更長期的研究和探討。

慢性疼痛中樞敏化的最終結(jié)果是傷害神經(jīng)信號的不斷上傳導(dǎo)致中樞水平突觸可塑性變化。樹突棘是微米級的樹突突起，可以調(diào)節(jié)突觸傳遞的功效。樹突棘可分為頭寬大于頸長的蘑菇型樹突和頭寬小于頸長的細長型樹突，疼痛的形成與蘑菇型樹突棘密度增加密切相關(guān)，蘑菇型樹突棘密度可以作為新的協(xié)助支慢性疼痛確診的生物標(biāo)記物之一[18,19]。本研究中高爾基染色結(jié)果顯示，RTX 小鼠脊髓背角神經(jīng)元樹突棘發(fā)生了形態(tài)學(xué)變化，RTX 組小鼠蘑菇型樹突棘密度增加，而BMSC 治療后，蘑菇型樹突棘密度降低（見圖6）。本研究結(jié)果證實了蘑菇型樹突棘與神經(jīng)病理性疼痛的相關(guān)性，BMSC 可以逆轉(zhuǎn)慢性疼痛狀態(tài)下已形成的樹突棘形態(tài)改變，對遲發(fā)性及慢性神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生治療作用。

已有的研究提示，膠質(zhì)細胞活化后，首先激活絲裂酶原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases, MAPKs) 典型的p38 通路，繼而啟動下游炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的釋放，炎性因子更進一步促進MAPK 信號的激活，進而引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致?lián)p傷及修復(fù)性改變[11]。本研究中注射RTX后不僅RTX 處理小鼠呈現(xiàn)顯著的痛覺過敏行為，且脊髓背角的小膠質(zhì)細胞標(biāo)志物CD11b 及p38 MAPK表達顯著增加，說明p38 MAPK 通路介導(dǎo)了小膠質(zhì)細胞激活后的炎癥損傷反應(yīng)。而BMSC 處理后顯著干預(yù)了脊髓p38 MAPK 蛋白表達水平，表明BMSC可能通過干預(yù)p38 MAPK 通路的免疫調(diào)節(jié)能力發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

綜上所述，小膠質(zhì)細胞的活化及p38 MAPK 參與了小鼠RTX 介導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的形成，通過靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細胞，可顯著改善RTX 小鼠的機械痛敏，骨髓間充質(zhì)干細胞可能是通過遷移至脊髓背角抑制小膠質(zhì)細胞活化、p38 MAPK 表達、改善樹突棘可塑性改變而達到鎮(zhèn)痛作用。本研究結(jié)果為干細胞應(yīng)用于臨床難治性神經(jīng)病理性疼痛提供了理論依據(jù)。