一種高尿酸血癥大鼠模型誘導方法的改良和效果評價研究*

石 慧，梁曉珊，黃麗文，羅之剛，譚 龍Δ

(1. 天津醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系，天津 300070； 2. 上海康識食品科技有限公司，上海 201103)

高尿酸血癥(hyperuricemia, HUA)是一種復合型代謝綜合征，是多種因素共同作用導致的嘌呤代謝紊亂，尿酸(uric acid, UA)生成增多和(或)排泄減少的疾病[1]。國際上定義高尿酸血癥的診斷標準為正常嘌呤飲食狀態(tài)下，非同日2次空腹血尿酸水平男性大于420 μmol /L(7.0 mg/dl)、女性大于357 μmol/L(6.0 mg/dl)，且沒有合并痛風的高尿酸血癥即為無癥狀高尿酸血癥[2]。有報道稱我國當前高尿酸血癥已達到13.3%，已成為高血壓、高血糖、高血脂之后的第四“高”[3]，多種疾病的發(fā)生與高尿酸血癥關(guān)聯(lián)密切[4, 5]。因此，高尿酸血癥也成為疾病研究和藥物開發(fā)的熱點之一。而無論是疾病機制研究還是藥物研發(fā)，都離不開動物模型的應用。在高尿酸血癥動物模型的誘導方法中，藥物法是最常見也是應用最廣泛的方法之一，但由于藥物誘導時存在誘導時間長、模型損失大、模型效果持續(xù)時間短等問題[6]，探索和優(yōu)化穩(wěn)定有效的模型誘導方法對于高尿酸血癥相關(guān)研究具有重要意義。

孟笑瑋曾對高尿酸血癥的嚙齒類動物模型誘導方法進行探索和評價[7]，篩選出利用酵母膏、腺嘌呤聯(lián)合氧嗪酸鉀誘導急性高尿酸血癥模型的方法，該方法簡單易于操作，效果明顯，但是該方法仍存在短時間(7 d)誘導效果不穩(wěn)定、灌胃體積過大易導致死亡、持續(xù)效果不確定等問題。本研究基于前期同類研究的經(jīng)驗，使用酵母膏聯(lián)合腺嘌呤灌胃，同時定期腹腔注射氧嗪酸鉀，造模一周，通過觀察比較不同用藥劑量和頻率的效果評價對模型誘導的效果，對已有造模方法進行優(yōu)化和改進，以獲得穩(wěn)定、持久、安全的高尿酸血癥大鼠模型，為高尿酸血癥相關(guān)研究提供可靠的模型來源。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠(北京市維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006)46只，6周齡，體重190～210 g。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所動物中心(屏障環(huán)境SPF級)，適應性喂養(yǎng)3 d后分組給予相應干預。

1.2 主要試劑及配制方法

酵母膏(北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司，中國)，氧嗪酸鉀(Sigma，美國)，腺嘌呤(Sigma，美國)，大鼠維持飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司，中國)，尿酸試劑盒及肌酐測試盒(南京建成生物工程研究所，中國)。

酵母膏與腺嘌呤混合物：酵母膏與蒸餾水按照5∶1(w∶v)的比例進行混勻，混勻后置于4℃保存，使用前需先經(jīng)溫水浴至30～35℃再行灌胃。

氧嗪酸鉀混懸液：準確稱取氧嗪酸鉀后，用滅菌生理鹽水配置成3%濃度的混懸液，使用前搖勻并經(jīng)溫水浴至30～35℃后再行注射。

1.3 動物分組與處理

經(jīng)適應性喂養(yǎng)后將大鼠隨機分為6組，其中對照組(CT組)6只，模型組(M1、M2、M3、M4、M5組)每組8只，各組干預方法見表1。造模期間各組自由飲水，夜間(19： 00～次日7： 00)禁食，造模持續(xù)7 d。造模前和造模結(jié)束后分別稱量體重。造模結(jié)束后用代謝籠收集所有大鼠24 h尿樣，眼內(nèi)眥取血備檢。之后繼續(xù)飼養(yǎng)2周，自由飲食、飲水，2周后再次代謝籠收集24 h尿樣，股動脈采集血樣并處死動物取腎臟和胃稱重備檢。

Tab. 1 The treatments of model inducing in different groups

1.4 指標檢測

造模結(jié)束后及動物處死后采集的血樣，分離出血清以生化試劑盒檢測血尿酸和血肌酐水平；尿樣采用代謝籠[Sans，中國(江蘇)，型號：SA105]收集大鼠24 h尿樣，測量體積后經(jīng)低速離心取上層尿液，以生化試劑盒檢測尿酸和肌酐水平。以肌酐對尿酸水平進行校正，計算尿酸肌酐比值。檢測過程均嚴格按照尿酸檢測試劑盒說明書進行。動物處死前稱量體重，處死后取胃(清除內(nèi)容物)和左側(cè)腎臟，稱量重量后計算臟器系數(shù)，臟器系數(shù)=某臟器重量(g)/該動物體重(g)。

1.5 HE染色觀察腎臟及胃形態(tài)學變化

生理鹽水清洗胃和腎臟殘留血液后，放于4%多聚甲醛液中固定，石蠟包埋、切片，HE染色，用Olympus光學倒置顯微鏡觀察腎臟組織形態(tài)，于200倍視野下拍照觀察。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠的生存情況

模型誘導持續(xù)7 d，在造模過程中，由于干預劑量的差異，各組大鼠反應明顯不同并出現(xiàn)死亡(表2)。其中M4組(7/8)以及M5組(8/8)因死亡率太高，導致后續(xù)檢測數(shù)據(jù)缺失，故未能納入后續(xù)數(shù)據(jù)分析。造模結(jié)束后繼續(xù)喂養(yǎng)2周，未再出現(xiàn)動物死亡。

Tab. 2 The number of death during the model inducing (the first week)

2.2 大鼠的生長情況

接受造模干預前各組大鼠體重無明顯差異(P>0.05)，造模結(jié)束后各模型組大鼠體重出現(xiàn)不同程度下降，顯著低于CT組大鼠(P<0.05),雖然隨干預強度的加大，模型組大鼠體重下降幅度也隨之加大，但各組間體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表3)。

Tab. 3 The body weight of rats before and after the model inducing (g,

2.3 大鼠的血尿酸、血肌酐水平的檢測

造模結(jié)束后，與CT組相比，M2和M3組大鼠血尿酸濃度均有明顯升高(P<0.01)，提示造模成功。M2組大鼠血尿酸水平比M3和M1組高(P< 0.01)。CT組與M1組大鼠血尿酸水平?jīng)]有顯著差異(P>0.05)。各模型組大鼠血肌酐濃度均高于對照組(P<0.05)，但各模型組之間大鼠血肌酐濃度沒有顯著差異(P>0.05)。以血肌酐校正計算的尿酸肌酐比與血尿酸的變化趨勢一致，各模型組血尿酸肌酐比均大于對照組(P<0.05)；M2組血尿酸肌酐比明顯大于M1和M3組(P<0.05)；M2組大鼠血尿酸肌酐比值與M3組相比沒有顯著差異(P= 0.142，表4)。

停止造模2周后，與對照組相比，3個模型組尿酸濃度仍然處于較高水平(M1：P=0.042；M2：P<0.01；M3：P=0.003)，且M2組尿酸水平顯著高于其他兩個模型組(P<0.05)。各模型組肌酐水平也維持在較高水平(P<0.05)，但各組的尿酸肌酐比值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表4)。

2.4 大鼠的24 h尿中尿酸、尿肌酐水平的檢測

造模結(jié)束時，各模型組尿尿酸和尿肌酐濃度均明顯高于CT組(P<0.05)，但各模型組間差異無統(tǒng)計學意義。在停止造模干預2周后，各模型組尿尿酸和尿肌酐水平仍顯著高于CT組(P<0.05)。各組間的尿酸肌酐比值在造模結(jié)束時以及2周后差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表5)。

2.5 大鼠腎臟及胃臟器系數(shù)的檢測

結(jié)果顯示，各模型組腎臟較CT組明顯增大，肉眼可見暗黃色網(wǎng)狀斑紋(花斑腎)。與CT組相比，各模型組大鼠腎臟重量均明顯增加(P<0.05)，腎臟臟器指數(shù)也顯著高于CT組(P<0.05)。其中，M1組腎臟增大程度高于M3組和M2組(P<0.05)；M2組與M3組間腎臟重量及腎臟臟器指數(shù)沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。與CT組相比，各模型組大鼠胃重量雖有增加，但只有M3組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.037)。模型組胃的臟器系數(shù)也有增大，其中M1(P=0.032)和M3(P=0.016)組與CT組相比差異有統(tǒng)計學意義,其他差異無統(tǒng)計學意義(表6)。

Tab. 4 The concentrations of blood uric acid, creatinine and the ratio of uric acid and creatinine in the 1st week and the 3rd week

Tab. 5 The concentrations of urine uric acid, creatinine and the ratio of uric acid and creatinine in the 1st week and the 3rd week

Tab. 6 The weight and organ coefficient of kidney

2.6 腎臟組織病理檢查

腎臟病理檢查顯示，CT組的腎臟組織未見病理改變，腎小球、腎小管無異常，小管官腔無結(jié)晶物沉淀，腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)無異常改變，無纖維組織增生。而3個模型組腎臟均出現(xiàn)充血、水腫，局部可見腎間質(zhì)炎細胞浸潤，腎小管結(jié)構(gòu)紊亂，局部腎小管與腎間質(zhì)界限模糊，腎小管上皮細胞水腫，腎小球萎縮，病理損傷明顯(圖1)。

Fig. 1 The morphological changes of kidneys after the model inducing among groups (HE ×200)

3 討論

隨著高尿酸血癥的研究增多，穩(wěn)定、重復性好的高尿酸血癥動物模型成為各項研究的重要基礎(chǔ)，然而目前高尿酸血癥動物模型的誘導方法仍然存在誘導周期長、模型穩(wěn)定性差、死亡率高等問題。本研究在已有研究的基礎(chǔ)上對用藥劑量和頻率進行優(yōu)化和改良[7]，獲得了可在較短時間內(nèi)成功誘導高尿酸血癥大鼠模型的方法。一般認為，高尿酸血癥形成原因主要是內(nèi)源性生成增加，外源性攝入增加和排泄減少[8]。本研究根據(jù)疾病發(fā)生的原因采用酵母膏、腺嘌呤聯(lián)合氧嗪酸鉀誘導大鼠高尿酸血癥模型，造模干預7 d即可顯著升高血尿酸濃度，并且停止造模后2周大鼠血尿酸水平仍維持在較高水平，模型效果明顯。相比而言，孟笑瑋的研究推薦酵母膏15～20 g/kg+腺嘌呤100 mg/kg+氧嗪酸鉀300 mg/kg尿酸升高幅度較小，模型效果維持時間較短(小于5 d)，并且還是存在動物死亡的問題(2/9-5/10)。而本研究中采用的低濃度酵母膏(10 g/kg)可以有效的降低動物死亡率，同時，增加氧嗪酸鉀的注射次數(shù)可以明顯延長模型效果。誘導方法的優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)，酵母膏作為增加嘌呤攝入的主要來源之一，存在消化速度慢、排空時間長的問題，雖然本研究結(jié)果顯示，短期灌胃未發(fā)現(xiàn)對胃的重量產(chǎn)生明顯影響，但使用劑量過大易造成動物消化不良甚至導致死亡，這種效應在聯(lián)合腺嘌呤共同使用時更加明顯，灌胃劑量在10 g/kg時，在控制其他藥物劑量的前提下有利于誘導模型，但是當酵母膏濃度升至20 g/kg以及30 g/kg時，動物死亡明顯增加，這與相關(guān)報道[9]不太一致，可能是聯(lián)合用藥的種類有所不同，但從安全角度考慮建議使用劑量應控制在10 g/kg左右。氧嗪酸鉀[10]是一種常用的尿酸酶抑制劑，能夠抑制大鼠體內(nèi)尿酸酶分解尿酸從而升高尿酸水平。本研究發(fā)現(xiàn)，腹腔內(nèi)注射氧嗪酸鉀對動物具有較強刺激性，可引起動物明顯疼痛和抽動，抑制其日?；顒雍惋嬍?，劑量過高可造成死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，采用間斷腹腔內(nèi)注射氧嗪酸鉀對于升高尿酸濃度效果明顯，并且不易引起個體死亡，而增加注射頻率(間接增加用藥劑量)可導致個體死亡風險增高。而采用單次注射方案時，由于前期持續(xù)攝入較多嘌呤，尿酸及前體物質(zhì)蓄積過多，注射后可能導致抑制尿酸分解的效應過強，進而導致死亡。多次注射則有利于緩解這種蓄積效應產(chǎn)生的過強反應，對實驗動物具有一定的保護作用。本研究中不同劑量誘導模型均可引起明顯的腎臟腫大，表面可見暗黃色斑紋，病理檢查結(jié)果表明，腎皮質(zhì)、髓質(zhì)均出現(xiàn)結(jié)構(gòu)破壞，炎細胞浸潤，提示尿酸沉積明顯并導致炎性病灶產(chǎn)生。說明本研究中所采用的的模型誘導方法效果明顯但作用較強，不適合作為長期干預方案。

綜上所述，本研究采用不同濃度酵母膏、腺嘌呤聯(lián)合氧嗪酸鉀誘導建立高尿酸血癥大鼠模型的方法有效，高尿酸狀態(tài)持續(xù)時間較長，建議采用酵母膏(10 g/kg)和腺嘌呤(100 mg/kg)每日灌胃2次，聯(lián)合間隔(第1、3、7日)腹腔注射氧嗪酸鉀(300 mg/kg)1次的誘導方案短期快速誘導高尿酸血癥模型，可供模型使用者參考。

衷心感謝王永明老師對本研究提出的技術(shù)指導和支持。