低氧條件下奧巴克拉聯(lián)合吉西他濱對乳腺癌細(xì)胞的作用*

宋海巖，張毅敏，連 輝，周 立

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

在實(shí)體腫瘤，缺氧是一種常見的特性,并成為促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的強(qiáng)大驅(qū)動力和治療失敗的主要原因[1, 2]。缺氧可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性改變及腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的變化，從而進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長更快、腫瘤細(xì)胞的侵襲力增強(qiáng)。乳腺癌是影響女性健康的最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位于惡性腫瘤之首[3]。

研究顯示吉西他濱(gemcitabine，GEM)是對乳腺癌有明顯的治療效果[4,5]，但由于其有較強(qiáng)的毒副作用及腫瘤細(xì)胞耐藥的發(fā)生，不僅影響治療效果，也影響患者的生存質(zhì)量。通過臨床前試驗(yàn)，奧巴克拉(obatoclax，OBX)可作為抑制劑抑制腫瘤細(xì)胞與移植瘤的生長[6]。本研究以乳腺癌MCF-3與BT-20為研究對象，研究在低氧條件OBX聯(lián)合GEM對腫瘤細(xì)胞活性、凋亡、遷移、侵襲能力的影響，為臨床乳腺癌的治療提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7與BT-20購自于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，培養(yǎng)液為DMEM(含10% FBS, 100 U/L青霉素及100 μg/ml鏈霉素)，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3 d傳代1次，對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑

DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)培養(yǎng)液 購自于Hyclone，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自于Gibco，gemcitabine、obatoclax 購自于Sigma公司，青鏈霉素溶液，CCK-8試劑盒購自于碧云天生物技術(shù)研究所，HIF-1α 抗體購自于BD Biosciences公司，GAPDH抗體購自于Sigma公司 ，vimentin抗體(sc-6260)，E-Cadherin抗體(sc-71009),p53抗體(sc-126)購自于SANTA CRUZ公司。

1.3 細(xì)胞分組

正常培養(yǎng)組；低氧組(低氧誘導(dǎo)條件為37℃，1%O2，5% CO2,94% N2)；

吉西他濱(GEM)(10 μmol/L)組；OBX(50 nmol/L)+吉西他濱(GEM)(10 μmol/L)組。正常培養(yǎng)組：37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h與48 h；低氧組：37℃，1%O2，5% CO2,94% N2條件下培養(yǎng)24 h與48 h；吉西他濱(GEM)組：37℃，1%O2，5% CO2,94% N2，加入終濃度為10 μmol/L的吉西他濱培養(yǎng)24 h與48 h；OBX+吉西他濱(GEM)組：37℃，1%O2，5% CO2,94% N2，加入終濃度為10 μmol/L的吉西他濱與終濃度為50 nmol/L的OBX培養(yǎng)24 h和48 h。

1.4 WB檢測低氧組與正常組HIF-1α的表達(dá)

接種MCF-3與BT-20細(xì)胞，37℃培養(yǎng)12 h后，低氧組細(xì)胞在低氧條件下培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入500 μl RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。SDS-PAGE電泳80V 30 min、120 V 1 h，轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，HIF-1α 抗體(1∶500)及GAPDH抗體(1∶10 000)4℃孵育過夜，熒光二抗室溫孵育1.5 h后，Odyssey掃膜。每組設(shè)置5個復(fù)孔。

1.5 CCK-8檢測細(xì)胞的活性

MCF-3與BT-20細(xì)胞接種于96孔中培養(yǎng)12 h，GEM組加入終濃度為10 μmol/L的GEM；OBX+GEM組加入終濃度為50 nmol/L的OBX和終濃度為10 μmol/L的GEM，低氧組、GEM組與OBX+GEM組于低氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入100 μl CCK-8，37℃培養(yǎng)2 h后，酶標(biāo)儀450 nm處測OD值。每組設(shè)置15個復(fù)孔。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

參考文獻(xiàn)[7]中報(bào)道，將細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)12 h后細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板底部，用1 ml的無菌藍(lán)色吸頭在孔的中間劃痕，盡量保證每一個孔中劃痕的寬度一致。棄去培養(yǎng)液，每孔加入1 ml無血清培養(yǎng)液以洗去懸浮的細(xì)胞，加入正常培養(yǎng)液，拍照并且記錄位置, 此處為0 h的劃痕，各組細(xì)胞處理方法如細(xì)胞分組中所述，各組均培養(yǎng)48 h，每組設(shè)置6個復(fù)孔，顯微鏡下觀察細(xì)胞的遷移情況并拍照，利用Image J軟件計(jì)算細(xì)胞愈合率。

1.7 WB檢測各組vimentin，E-Cadherin, p53的表達(dá)

培養(yǎng)24 h的各組細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，每皿加入500 μl RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。常規(guī)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，vimentin 抗體(1∶500)、E-Cadherin抗體(1∶500)、p53抗體(1∶500)及GAPDH抗體(1∶10 000)4℃孵育過夜，熒光二抗室溫孵育1.5 h后，Odyssey曝光，Image J軟件分析灰度值。每組設(shè)置5個復(fù)孔。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 低氧條件下HIF-1α的表達(dá)情況

Western blot結(jié)果顯示：正常氧條件下，MCF-7與BT-20細(xì)胞中并不表達(dá)HIF-1α(0.000±0.00)；而在低氧條件下，MCF-7與BT-20細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)顯著(0.457±0.019, 0.443±0.011)，二者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

Fig. 1 The expression of HIF-1α in MCF-7 and BT-20 cells under normal oxygen and hypoxia condition

2.2 低氧條件下GEM與OBX+GEM對細(xì)胞活性的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示：與正常氧組相比，低氧組MCF-7與BT-20細(xì)胞活性明顯升高(P<0.05)；與低氧組相比較，GEM組與OBX+GEM組細(xì)胞活性均有下降(P<0.05)，OBX+GEM組細(xì)胞與GEM組細(xì)胞相比較，細(xì)胞活性進(jìn)一步降低(P<0.01)，這就提示，OBX聯(lián)合GEM可顯著降低低氧條件下MCF-7與BT-20細(xì)胞的活性(表1)。

Tab. 1 Cell activity of MCF-7 and BT-20 cells detected by CCK-8 n=15)

2.3 低氧條件下GEM與OBX+GEM對細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與正常氧組比較，低氧組 MCF-7與BT-20細(xì)胞的愈合面積明顯大于正常氧對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與低氧組相比較，GEM與OBX+GEM組細(xì)胞的愈合面積顯著降低(P<0.01)，并且OBX+GEM組細(xì)胞的愈合面積下降的更為顯著，這表明OBX聯(lián)合GEM可顯著降低低氧條件下MCF-7與BT-20細(xì)胞的遷移能力(圖2，表2)。

Fig. 2 Migration ability of MCF-7 and BT-20 cells detected by scratch experiment

Tab. 2 Migration ability of MCF-7 and BT-20 cells detected by scratch experiment(% wound closure) n=6)

2.4 低氧條件下GEM與OBX+GEM對相關(guān)蛋白的影響

Western blot結(jié)果如圖3，表3所示：與正常氧組比較，低氧組MCF-7細(xì)胞中vimentin的表達(dá)顯著升高(P<0.01)，而E-Cadherin的表達(dá)顯著降低(P< 0.01), p53蛋白的表達(dá)無明顯改變；與低氧組相比較，GEM組與OBX+GEM組，vimentin的表達(dá)降低(P<0.01)，E-Cadherin的表達(dá)顯著升高(P<0.01)，p53蛋白的表達(dá)也顯著升高(P<0.01)，并且OBX+GEM組的作用更顯著，這表明OBX聯(lián)合GEM作用于低氧條件下的MCF-7細(xì)胞，細(xì)胞特性發(fā)生改變，從間質(zhì)樣特征恢復(fù)上皮樣特征，同時(shí)細(xì)胞凋亡相關(guān)p53的表達(dá)顯著升高，OBX聯(lián)合GEM可促進(jìn)低氧條件下的細(xì)胞凋亡。

Fig. 3 The expressions of vimentin, E-cadherin and p53 protein in each group of MCF-7 cells detected by Western blot

Tab. 3 The expressions of vimentin, E-cadherin and p53 protein in each group of MCF-7 cells detected by Western blot (Relative gray density) n=5)

3 討論

乳腺癌是影響全世界女性健康最常見的惡性腫瘤之一,據(jù)最新統(tǒng)計(jì),其發(fā)病率在全世界女性腫瘤疾病中列第一位,引起女性死亡相關(guān)癌癥的第一大因素[3]。盡管，目前隨著化療藥物的迅猛發(fā)展，乳腺癌患者的生存期有較大程度的延長，但是對耐藥患者的治療效果還不容樂觀。

惡性腫瘤在發(fā)展的過程中，由于生長過快腫瘤細(xì)胞常常處于氧氣與營養(yǎng)不足的狀態(tài)，在實(shí)體腫瘤，缺氧是一種常見的特性,并成為促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的強(qiáng)大驅(qū)動力和治療失敗的主要原因[1, 2]。低氧可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性改變，腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的變化，藥物的輸送障礙及腫瘤細(xì)胞對藥物耐藥的發(fā)生，從而進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長更快，細(xì)胞出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition ，EMT)，腫瘤細(xì)胞的侵襲力增強(qiáng)[8-10]。在EMT過程中，E-Cadherin的表達(dá)下調(diào)，預(yù)示著腫瘤細(xì)胞失去其上皮樣特征，同時(shí)間質(zhì)標(biāo)記物vimentin的表達(dá)上調(diào)，這種轉(zhuǎn)換會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞遷移侵襲的能力增強(qiáng)，增加腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[11, 12]。因此，針對低氧條件下細(xì)胞特征而采用的治療策略可能取得較好的治療效果。

吉西他濱為脫氧胞嘧啶核苷的類似物, 是核苷酸還原酶抑制劑, 在細(xì)胞內(nèi)通過脫氧胞嘧啶核苷激酶磷酸化, 轉(zhuǎn)化成具有活性的二磷酸及三磷酸核苷, 從而發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。研究顯示吉西他濱對乳腺癌有明顯的療效，但由于其有較強(qiáng)的毒副作用及腫瘤細(xì)胞耐藥的發(fā)生，不僅影響治療效果，也影響患者的生存質(zhì)量。通過臨床前試驗(yàn)，奧巴克拉(obatoclax，OBX)是一種BH3類似物，可作為抑制劑抑制腫瘤細(xì)胞與移植瘤的生長[6]。與正常氧條件相比較，在低氧條件下，BH3類似物ABT-737更能發(fā)揮其對腫瘤細(xì)胞的作用效率[13, 14]。研究顯示，奧巴克拉可降低低氧條件HIF-1α的表達(dá)水平，從而提高結(jié)腸癌細(xì)胞對5-fluorouracil的敏感性[15]。但是奧巴克拉聯(lián)合吉西他濱是否能改變低氧條件下乳腺癌細(xì)胞的侵襲性表型，提高吉西他濱的作用效率，還未見報(bào)道。

本研究中結(jié)果顯示，在低氧條件下，乳腺癌細(xì)胞MCF-7與BT-20的遷移能力增強(qiáng)，細(xì)胞活性增強(qiáng)，奧巴克拉聯(lián)合小劑量的吉西他濱可顯著降低二者的愈合面積，降低它們的遷移能力與活性；奧巴克拉聯(lián)合小劑量的吉西他濱，可改變?nèi)橄侔┘?xì)胞MCF-7細(xì)胞的惡性表型，促進(jìn)上皮標(biāo)記物E-Cadherin的表達(dá)，降低間充質(zhì)標(biāo)記物Vimentin的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞恢復(fù)上皮樣細(xì)胞的特征，降低腫瘤細(xì)胞遷移侵襲的能力，促進(jìn)p53的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而提高腫瘤細(xì)胞對吉西他濱的敏感性。本研究針對低氧條件下細(xì)胞特征，將奧巴克拉與吉西他濱聯(lián)合使用，通過減少吉西他濱的用量，減少其毒副作用，提高吉西他濱的作用效率，也減輕病人的痛苦。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在低氧條件下，OBX聯(lián)合小劑量吉西他濱可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，遷移，侵襲，增強(qiáng)吉西他濱對乳腺癌細(xì)胞的促凋亡作用，將為臨床乳腺癌的治療提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。