利拉魯肽聯(lián)合維生素D對(duì)高脂誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝小鼠的影響及機(jī)制*

王 鋒，張海峰

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，呼和浩特 010110)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver, NAFLD)是世界范圍內(nèi)常見的慢性肝病。盡管胰島素抵抗可能在NAFLD發(fā)病中發(fā)揮重要作用，但越來越多證據(jù)表明NAFLD與代謝綜合征也相關(guān)[1]。利拉魯肽是胰高血糖素樣肽-1類似物，是治療2型糖尿病一種新型藥物。近年研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽可間接通過調(diào)節(jié)AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)，改善高脂飲食喂養(yǎng)大鼠胰島素抵抗和肝臟脂質(zhì)沉積[2]。也有證據(jù)表明，維生素D可能是天然胰島素增敏劑[3]。維生素D3攝入可改善動(dòng)物模型胰島素抵抗和肝臟脂肪變化，可能與AMPK有關(guān)[4]。Shalata等人報(bào)道，維生素D可增強(qiáng)二甲雙胍治療肝脂肪變性療效，并降低肝臟中甘油三酯和丙二醛含量[5]。但是利拉魯肽聯(lián)合維生素D在NAFLD中作用仍不明確。因此，本研究旨在探討利拉魯肽聯(lián)合維生素D對(duì)高脂誘導(dǎo)NAFLD小鼠的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

利拉魯肽注射液(丹麥諾和諾德公司)；維生素D(浙江醫(yī)藥股份有限公司)；胰島素ELISA試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司)；HE染料(美國(guó)Sigma公司)；胰島素、甘油三酯和膽固醇試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；p-AMPK和-actin多克隆抗體(美國(guó)Santa公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及處理

雄性C57BL/6小鼠(20～25 g)，購(gòu)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(蒙)2015-0001)。飼養(yǎng)室內(nèi)溫度保持在(23±2)℃左右，明暗周期12 h，自由飲水和進(jìn)食。將C57BL/6小鼠隨機(jī)分成5組：對(duì)照組、NAFLD模型組、利拉魯肽組、維生素D組和利拉魯肽聯(lián)合維生素D組，每組均為10只小鼠。對(duì)照組采用普通飼料連續(xù)喂養(yǎng)12 周; 模型組采用高脂飼料(60%普通飼料、35%豬油、5%膽固醇)連續(xù)喂養(yǎng)12周; 利拉魯肽組、維生素D組和聯(lián)合組均采用高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)12周, 從第9周起上述3組小鼠分別腹腔注射0.6 mg/(kg·d)利拉魯肽、灌胃250 mg/(kg·d)維生素D和腹腔注射0.6 mg/(kg·d)利拉魯肽及灌胃250 mg/(kg·d)維生素D。喂養(yǎng)8周時(shí)，隨機(jī)處死對(duì)照組和模型組小鼠各1只，行肝組織切片檢查肝細(xì)胞脂肪變性情況，以確認(rèn)模型制備成功。

1.3 一般指標(biāo)測(cè)定

在12周喂養(yǎng)后，各組小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)進(jìn)行麻醉。靜脈抽取血液后，迅速切除和稱重肝臟和內(nèi)臟脂肪。然后儲(chǔ)存在-20℃冰箱中，以便進(jìn)一步分析。

1.4 外周血液中生化指標(biāo)測(cè)定

從-20℃冰箱中取出儲(chǔ)存的血漿，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)空腹血糖、甘油三酯、膽固醇、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)濃度。采用胰島素ELISA試劑盒檢測(cè)血漿離心后上清中的胰島素，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

1.5 肝組織脂質(zhì)含量測(cè)定

取出肝組織，置于1 ml無水乙醇的勻漿介質(zhì)中, 制備成10%的肝組織勻漿. 4℃條件下以 12 000×g/min離心10 min, 收集上清液。采用ELISA試劑盒檢測(cè)肝組織勻漿上清液甘油三酯和膽固醇含量。

1.6 肝臟組織學(xué)分析

取小鼠肝組織，10%的福爾馬林固定，包埋在新鮮石蠟中。采用石蠟切片機(jī)切片(5 μm), 經(jīng)脫蠟后,蘇木素染色液浸泡5 min, 雙蒸水洗滌1 min后，1%鹽酸酒精分化30 s, 1%Na2HPO4·12H2O溶液返藍(lán)1 s，1%伊紅染色液浸泡3 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片, 顯微鏡下觀察。采用NAFLD活動(dòng)評(píng)分評(píng)估脂肪變性。

1.7 免疫印跡分析

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組體質(zhì)量、肝臟和內(nèi)臟脂肪臟器系數(shù)的變化

如表1所示，各組小鼠初始體重?zé)o差別。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型組小鼠內(nèi)臟脂肪重量較對(duì)照組增加近一倍(P<0.01，表1)，其他組內(nèi)臟脂肪也輕度增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而各組小鼠最終體重和肝臟/體重比值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Tab. 1 Body and tissue weight-related n=9)

2.2 各組血液生化指標(biāo)的變化

如表2所示，各組小鼠甘油三酯和膽固醇濃度均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與對(duì)照組相比，模型組小鼠血糖水平、胰島素抵抗指數(shù)較高，而胰島素水平較低(P<0.05)。利拉魯肽組、維生素D組和聯(lián)合組均可改善血糖、胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù)(P<0.05)，而且聯(lián)合組胰島素抵抗指數(shù)顯著低于利拉魯肽和維生素D組(P<0.05)。模型組小鼠血清ALT和AST水平高于對(duì)照組(P<0.05)。利拉魯肽組、維生素D組和聯(lián)合組均可降低ALT和AST水平(P<0.05)，而且聯(lián)合組ALT和AST水平低于利拉魯肽和維生素D組(P<0.05)。

Tab. 2 Serum biochemical n=9)

2.3 各組肝臟脂質(zhì)含量的變化

與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟甘油三酯和膽固醇中含量顯著增加(P<0.05)，其他治療組甘油三酯和膽固醇沉積則顯著減少(P<0.05)，而且聯(lián)合組甘油三酯和膽固醇水平低于利拉魯肽和維生素D組(P<0.05，表3)。

Tab. 3 Comparison of lipid contents in liver of mice in each n=5)

2.4 各組肝組織形態(tài)學(xué)的變化

HE染色顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟顯示出脂肪肝跡象，伴有脂肪變性，無炎癥跡象；而其他治療組脂肪變性降低。與對(duì)照組相比，模型組小鼠NAFLD活動(dòng)評(píng)分顯著增高(P<0.05)，其他治療組NAFLD活動(dòng)評(píng)分則顯著降低(P<0.05)，而且聯(lián)合組NAFLD活動(dòng)評(píng)分低于利拉魯肽和維生素D組(P<0.05，圖1，表4)。

Fig. 1 Typical HE staining of mice in each group

Tab. 4 NAFLD activity score of mice in each n=5)

2.5 各組肝組織AMP活化蛋白激酶(AMPK)磷酸化水平的變化

免疫印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠p-AMPK表達(dá)顯著降低(P<0.05)，其他治療組p-AMPK表達(dá)則顯著增加(P<0.05)，而且聯(lián)合組p-AMPK表達(dá)高于利拉魯肽組(P<0.05，圖2，表5)。

Fig. 2 Typical immunoblotting map in each group

Tab. 5 Quantitative analysis of p-AMPK in each n=5)

3 討論

近年來NAFLD在人群中發(fā)病率很髙，而且其也是肝硬化和肝衰竭的原因，故預(yù)防NAFLD具有重要的意義。目前認(rèn)為NAFLD主要是由胰島素抵抗誘發(fā)肝臟脂質(zhì)蓄積為特征的肝損傷，而且常伴發(fā)肥胖和高血脂等[6]。利拉魯肽是胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑，可降低糖尿病患者血糖、血脂和體重，并改善胰島素抵抗[7]。近年研究顯示，利拉魯肽可降低NAFLD大鼠甘油三酯、膽固醇和ALT等，具有保護(hù)肝臟作用[8]。而維生素D也可提高胰島素敏感性、激活脂肪組織中Ca2+介導(dǎo)的凋亡途徑、抑制脂肪生成和促進(jìn)脂質(zhì)氧化代謝[9]。有研究報(bào)道，維生素D缺乏或不足可能與NAFLD有關(guān)[10]。然而利拉魯肽聯(lián)系維生素D對(duì)高脂誘導(dǎo)NAFLD小鼠的影響鮮有報(bào)道。

在本實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠血清空腹血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、ALT和AST均明顯高于對(duì)照組。胰島素抵抗在NAFLD發(fā)病中起重要作用，貫穿于NAFLD全過程。在本研究中，不管是利拉魯肽或維生素D組單獨(dú)/聯(lián)合治療均可降低NAFLD小鼠血清中胰島素抵抗。胰島素抵抗引起NAFLD 的可能機(jī)制是使外周脂肪分解增強(qiáng)，血清中游離脂肪酸濃度增加，導(dǎo)致肝內(nèi)甘油三酯大量合成堆積[11]。模型組小鼠肝臟中甘油三酯和膽固醇含量顯著高于對(duì)照組，這與以往相關(guān)研究結(jié)果是一致的[12]。此外，利拉魯肽或維生素D組單獨(dú)/聯(lián)合治療也可降低NAFLD小鼠血清中ALT和AST，以及肝臟中甘油三酯和膽固醇含量，而且聯(lián)合組效果顯著高于利拉魯肽或維生素D組。Zhang等人采用低脂聯(lián)素水平載脂蛋白E敲除小鼠發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽干預(yù)8 周可明顯改善高脂誘導(dǎo)小鼠肝臟脂肪堆積改善肝臟組織學(xué)的變化[13]。Nakano等人研究得出，肝組織炎癥和纖維化，隨著活性維生素D3升高而得到改善更顯著[14]。另外，利拉魯肽或維生素D組單獨(dú)/聯(lián)合組NAFLD活動(dòng)評(píng)分顯著低于模型組，而且聯(lián)合組NAFLD活動(dòng)評(píng)分低于利拉魯肽和維生素D組。以往有研究報(bào)道，與單純高脂飲食飼養(yǎng)者相比, 維生素D缺乏高脂飲食飼養(yǎng)幼鼠肝小葉炎癥更明顯，而且NAFLD活動(dòng)評(píng)分明顯升高[15]。本研究結(jié)果提示利拉魯肽和維生素D聯(lián)合治療小鼠NAFLD具有協(xié)同作用。由于AMPK在利拉魯肽改善高脂飲食喂養(yǎng)大鼠胰島素抵抗和肝臟脂質(zhì)沉積中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]，所以本研究進(jìn)一步觀察各組小鼠中AMPK激活情況，免疫印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠p-AMPK表達(dá)顯著降低，其他治療組p-AMPK表達(dá)則顯著增加，而且聯(lián)合組p-AMPK表達(dá)高于利拉魯肽組。上述結(jié)果提示，利拉魯肽和維生素D可能是通過調(diào)節(jié)胰島素抵抗和AMPK激活發(fā)揮協(xié)同作用。

總之，利拉魯肽聯(lián)合維生素D在治療高脂誘導(dǎo)小鼠NAFLD具有協(xié)同作用，其機(jī)制可能與胰島素抵抗改善和AMPK激活增加相關(guān)。