低溫對(duì)離體大鼠心室肌復(fù)極時(shí)程的影響及其機(jī)制*

符?？瑒⑵G秋，高 鴻，王貴龍，李華宇，代東君

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院 貴陽 550001； 2. 貴陽市第四人民醫(yī)院麻醉科 貴陽 550002； 3. 貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 都勻 558000)

體溫是重要的生命體征之一，麻醉手術(shù)期間由于多種因素破壞機(jī)體產(chǎn)熱與散熱之間的平衡，導(dǎo)致患者體溫降低，臨床上以亞低溫(32-35℃)最為常見[1-2]。而低體溫可引起QT間期延長、室內(nèi)傳導(dǎo)阻滯、嚴(yán)重竇性心動(dòng)過緩、房顫、室顫等心律失常[3-4]。心律失常的發(fā)生與心肌細(xì)胞膜上離子通道表達(dá)或功能異常有關(guān)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[5]，隨著溫度下降，離體大鼠心室肌單相動(dòng)作電位時(shí)程(monophasic action potential duration, MAPD)延長、跨室壁復(fù)極離散度(transmural dispersion of repdarization, TDR)增大等電生理改變均與心室復(fù)極異常密切相關(guān)。內(nèi)向整流鉀電流(inward rectifier potassium current, Ik1)通道存在于心室肌和心房肌細(xì)胞, 主要生理作用是維持靜息膜電位的穩(wěn)定和可興奮細(xì)胞的興奮。Ik1的主要組成成份是Kir2.1, 是構(gòu)成心肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極末期(3期)的主要電流之一[6]。目前認(rèn)為Kir2.1與心房顫動(dòng)、Anderson綜合征、多形性室速、短QT間期綜合征等心律失常疾病有關(guān)[6]。內(nèi)向整流鉀通道(the inward rectifying potassium channel，Kir)由其電壓-電流關(guān)系得名，其中Kir2.1蛋白可控制細(xì)胞的興奮性，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞晚期復(fù)極化和動(dòng)作電位時(shí)程。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察不同低溫處理對(duì)離體大鼠心室肌復(fù)極時(shí)程及Kir2.1蛋白表達(dá)、分布的影響，為低溫誘發(fā)心律失常的電生理機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康成年雄性SD大鼠(SPF級(jí))，體重280～360 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，食水不限，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為3組(n=6)：37℃組(C組)、35℃低溫組(H1組)、32℃低溫組(H2組)。

1.2 Langendorff離體心臟灌注模型的制備及處理

經(jīng)腹腔注射肝素3125 U/kg、戊巴比妥鈉60 mg/kg后迅速開胸取心臟，參照文獻(xiàn)[7]連接Langendorff裝置(上海奧爾科特)，用95%O2—5%CO2混合氣體平衡的K-H液于37℃下進(jìn)行非循環(huán)式逆行灌注，灌注壓為3.6 kPa。各組均用37℃ K-H液平衡灌注15 min后，通過恒溫槽及熱交換器分別控制三組K-H液溫度為37℃、35℃及32℃。C組繼續(xù)灌注37℃ K-H液30 min；H1組繼續(xù)灌注35℃ K-H液30 min，H2組繼續(xù)灌注32℃ K-H液30 min。

1.3 電生理數(shù)據(jù)采集

參照文獻(xiàn)[7-8]于平衡灌注15 min后，從左心室前壁分別插入電極至外膜層、中膜層、內(nèi)膜層，參考電極置于主動(dòng)脈根部。采用BL-420F系統(tǒng)(成都泰盟)記錄單相動(dòng)作電位(monophasic action potential, MAP)及平衡灌注15 min (T0)、繼續(xù)灌注30 min(T1)的HR，計(jì)算左心室前壁三層心肌單相動(dòng)作電位復(fù)極50%、90%的時(shí)程(MAPD50、MAPD90)、跨室壁復(fù)極離散度(TDR)，觀察心臟灌注過程中心律失常的發(fā)生情況。

1.4 Western blot法測定Kir2.1蛋白表達(dá)

灌注結(jié)束后，取電生理指標(biāo)測定位置的心室肌,每100 g左心室心肌組織加入適當(dāng)細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑(PMSF)，冰上勻漿，運(yùn)用BCA蛋白濃度測定試劑盒(索寶)進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)分子量大小，制備12%的分離膠注入制膠板的下層，30 min后，制備5%的濃縮膠注入制膠板的上層，上層膠電壓80 V，下層膠電壓120 V進(jìn)行電泳，200 mA恒電流轉(zhuǎn)膜2 h，用封閉液封閉2 h，分別孵育兔抗大鼠Kir2.1 抗體(1∶8 000)4℃孵育過夜，加用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶8 000)室溫孵育1 h。ECL顯色后曝光，顯影。采用Image LAB(Bio—Rad)分析，通過Kir2.1蛋白條帶積分光密度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶積分光密度值的比值反映Kir2.1蛋白表達(dá)。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測心肌Kir2.1蛋白的分布

采用PV6001Two-Step IHC Detection Reagent二步法檢測心室肌組織抗原表達(dá)。石蠟包埋組織連續(xù)切片3 μm厚，脫蠟、水化；3%過氧化氫室溫孵育10 min，采用高壓熱修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，以兔抗大鼠(Kir2.1抗體)作為一抗過夜，每張切片加 50 μl羊抗兔 IgG 抗體-HRP多聚體37℃孵育30 min，每張切片 100 μl DAB染色液顯色，顯微鏡下觀察，出現(xiàn)棕黃色后即可將切片放入自來水中終止反應(yīng)。自來水沖洗蘇木素復(fù)染，脫水透明、中性樹膠封片。以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色物質(zhì)者定為Kir2.1陽性細(xì)胞。利用IMAGEJ圖像分析系統(tǒng)測定陽性細(xì)胞的平均光密度值(average optical density, AOD)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組心率的比較

T0時(shí)各組間心率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與T0時(shí)比較，T1時(shí)H1組、H2組心率均減慢(P<0.05)。組間比較顯示：與C組比較，T1時(shí)H1組、H2組心率均有減慢(P<0.05)；與H1組比較，H2組心率減慢(表1)。

Tab. 1 Comparison of heart rates in each group(beats/min, n=6)

2.2 各組心肌MAPD50的比較

T0時(shí)各組間MAPD50無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與T0時(shí)比較，T1時(shí)H2組MAPD50延長。組間比較顯示：與C組比較，T1時(shí)H2組MAPD50延長(P<0.05)；與H1組比較，T1時(shí)H2組MAPD50延長(P<0.05，表2)。

2.3 各組心肌MAPD90的比較

T0時(shí)各組間MAPD90之間無顯著差異；與T0時(shí)比較，T1時(shí)H1組、H2組MAPD90均延長(P<0.05)。組間比較顯示：與C組比較，T1時(shí)H1組、H2組MAPD90均延長(P<0.05);與H1組比較，T1時(shí)H2組MAPD90延長(P<0.05，表3)。

2.4 各組心肌TDR的比較

T0時(shí)點(diǎn)各組間TDR無顯著差異。與T0時(shí)比較：T1時(shí)H1組、H2組TDR增大(P<0.05)。組間比較顯示：與C組比較，T1時(shí)H1組、H2組TDR增大(P>0.05)，與H1組比較，H2組TDR增大(P< 0.05，表4)。

Tab. 2 Comparison of myocardial MAPD50 in each group(ms, n=6)

Tab. 3 Comparison of myocardial MAPD50 in each group(ms, n=6)

Tab. 4 Comparison of TDR in each group(ms, n=6)

2.5 各組心律失常發(fā)生情況的比較

灌注過程中H1組發(fā)生1例心律失常；H2組發(fā)生3例心律失常。組間比較顯示：灌注過程中，與C組比較，H2組心率失常發(fā)生率增加(P<0.05)；與H1組比較，H2組心率失常發(fā)生率增加(P<0.05)。

2.6 各組間Kir2.1蛋白表達(dá)的比較

Western blot法結(jié)果表明：C組Kir2.1蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)。與C組比較，H1組、H2組心室肌Kir2.1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，而H1組、H2組間Kir2.1蛋白表達(dá)無明顯差異(P>0.05，表5、圖1)。

免疫組織化學(xué)法結(jié)果表明：C組Kir2.1均勻分布，形態(tài)規(guī)整，未見明顯異常；而H1組及H2組表達(dá)減少且分布不均，著色大小不一，多分布于心肌細(xì)胞測-測連接處。與C組比較，H1組和H2組心室肌Kir2.1蛋白AOD降低(P<0．05)，而H1組、H2組間AOD值無明顯差異(P>0.05，表5、圖2)。

Tab. 5 Comparison of Kir2.1/GAPDH and AOD in each n=6)

Fig. 1 Expression of Kir2.1 protein in left ventricular muscle in each group

Fig. 2 Kir2.1 immunohistochemical staining of myocardial tissue(×400)

3 討論

心肌單相動(dòng)作電位MAP能反映心肌細(xì)胞的除極和復(fù)極化過程，MAPD50、MAPD90分別為復(fù)極化達(dá)到50%、90%的心肌動(dòng)作電位時(shí)程，對(duì)應(yīng)復(fù)極2相和3相，與QT間期的長短有密切關(guān)系[8]。因此本實(shí)驗(yàn)觀察不同低溫對(duì)離體鼠心室肌MAP的影響及Kir2.1蛋白在其中的作用，探討低溫所致心律失常的電生理機(jī)制。

參與心律失常發(fā)生的離子通道有ICa、INa、Iks、Ikr、Ito、IkATP等[9-10]。其中快激活延遲整流鉀電流Ikr、慢激活延遲整流鉀電流Iks和內(nèi)向整流鉀電流Ik1均參與心肌細(xì)胞的3相復(fù)極過程[10-11]。而內(nèi)向整流鉀通道(the inward rectifierpotassium channel，Kir)占總Ik1電流的80%以上，是復(fù)極3相的主要電流。Kir2.1是組成Ik1的主要通道蛋白，其整流特性有利于維持細(xì)胞的靜息電位，并使之接近鉀離子的平衡電位，是維持正常動(dòng)作電位的主要成分[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著Kir2.1蛋白水平表達(dá)的上升或下降，Ik1的升高或降低能導(dǎo)致心房/心室肌靜息膜電位發(fā)生改變，使復(fù)極化時(shí)程加快或減慢，產(chǎn)生電生理重構(gòu)，室性心律失常的易感性增加，最終誘發(fā)心律失常[13-14]。

在本研究中，誘發(fā)心律失常的原因可能是低溫減少心室肌細(xì)胞復(fù)極儲(chǔ)備，抑制K+外流，延長MAPD，造成不同部位心肌復(fù)極不同步所致[15]。動(dòng)作電位中復(fù)極的2相與3相涉及多種離子通道的共同參與，跨膜復(fù)極電位正常時(shí)，本身就存在一個(gè)低幅的震蕩電位，在離子通道功能出現(xiàn)變化時(shí)可使震蕩電位的振幅升高，達(dá)到除極的閾電位就將形成一次新的除極活動(dòng)，即早后除極(early after depolarization, EAD)，從而啟動(dòng)折返性心律失常的發(fā)生[15]。

另外，低溫誘發(fā)的Kir2.1蛋白表達(dá)水平下調(diào)會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極末期(3期)和靜息電位期(4期)的主要電流通道Ik1大量關(guān)閉，Ik1離子通道區(qū)域密度下降，以致動(dòng)作電位3期快速復(fù)極化的電流強(qiáng)度減小，復(fù)極時(shí)程延長，最終誘發(fā)心室折返及心律失常。同時(shí)在低溫下心肌細(xì)胞Kir2.1的分布紊亂會(huì)導(dǎo)致Kir2.1離子通道密度的區(qū)域性不同，導(dǎo)致出現(xiàn)不同的Ik1電流強(qiáng)度，在不同強(qiáng)度電流影響下動(dòng)作電位時(shí)程出現(xiàn)不均一性，致使復(fù)極不均一下增加，進(jìn)一步導(dǎo)致折返性心律失常發(fā)生[16]。抑制KCNJ2基因可下調(diào)Kir2.1的表達(dá)繼而影響心室復(fù)極，低溫引起的Kir2. 1蛋白下調(diào)及分布紊亂原因可能涉及KCNJ2/Kir2.1/Ik1通路[17]。有研究表明通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)蛋白構(gòu)象改變以及Ca2+濃度也可能誘導(dǎo)心肌動(dòng)作電位復(fù)極化改變，這也有可能低溫誘發(fā)心律失常的發(fā)生機(jī)制之一，有待進(jìn)一步試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證[18]。

本研究提出低溫可能誘發(fā)心率失常的機(jī)制，為進(jìn)一步探討其發(fā)生原因、研究治療方案提供一定線索。目前有研究提示Ik1激動(dòng)劑zacopride具有激活Kir2.1通道、逆轉(zhuǎn)心肌復(fù)極時(shí)程的延長、減輕心室肌電生理重構(gòu)從而治療和預(yù)防心律失常的作用，針對(duì)本研究對(duì)低溫誘發(fā)心律失常發(fā)生機(jī)制的探討，Ik1激動(dòng)劑可能有預(yù)防及治療低溫誘發(fā)的心律失常的作用，但需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)[19]。

綜上所述，低溫會(huì)延長大鼠心室肌動(dòng)作電位時(shí)程并增加復(fù)極離散度，增加心率失常的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，其機(jī)制與低溫下調(diào)Kir2.1蛋白表達(dá)、誘發(fā)Kir2.1分布紊亂、影響Ik1電流有關(guān)。