過表達(dá)miR-31對結(jié)腸炎模型小鼠TLR4/NF-κB信號(hào)通路及凋亡蛋白的調(diào)控*

劉凱麗，都新新，張文琴，吳亞俐，王 茜，王春芳，崔香麗

(山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系，太原 030001)

炎癥性腸病 (inflammatory bowel disease，IBD) 包括兩種慢性的炎癥性疾?。簼冃越Y(jié)腸炎和克羅恩病，其發(fā)病率和患病率在全球范圍內(nèi)均呈上升趨勢，IBD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病因尚不清楚，目前已有的治療方法仍存在問題，因此闡明IBD的潛在的機(jī)制非常重要[1]，而細(xì)胞凋亡和炎癥是結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)理中最重要的兩個(gè)因素[2]。Toll樣受體(toll-like receptors, TLR4)是跨膜蛋白家族受體，在非特異性或先天性免疫防御中起關(guān)鍵作用[3]，TLR4是TLRs家族中的一個(gè)關(guān)鍵元素。有研究表明，經(jīng)外部刺激后，生物體啟動(dòng)先天免疫反應(yīng)，上調(diào)TLR4表達(dá)，TLR4激活增加NF-κB的表達(dá)，并誘導(dǎo)一系列炎癥因子的表達(dá)[4]。因此，TLR4 / NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是炎癥發(fā)展的重要途徑。

miRNA是一類具有22～24個(gè)核苷酸的小非編碼RNA，有研究表明，miRNAs是炎癥信號(hào)通路的重要介導(dǎo)因子和調(diào)節(jié)因子，參與包括IBD在內(nèi)的多種炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制[5]。本實(shí)驗(yàn)室前期通過基因芯片技術(shù)檢測出miR-31在潰瘍性結(jié)腸炎病人的結(jié)腸炎組織和正常組織中有顯著差異性表達(dá)，因此本文使用miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠，通過DSS誘發(fā)腸炎模型，初步探究miR-31過表達(dá)對潰瘍性結(jié)腸炎中TLR4/NF-κB信號(hào)通路和凋亡相關(guān)蛋白的影響，為潰瘍性結(jié)腸炎的治療提供新的思路和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

SPF級miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誇VB小鼠30只，6～8周齡，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重為20～30 g，雌雄不限。人的腸上皮細(xì)胞系HCT 116購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。DSS購自美國MP Biomedicals公司。高鐵飼料購自北京華阜康生物公司。轉(zhuǎn)染試劑購自德國Qiagen公司。micrONTM miRNA mimic、micrOFFTM miRNA inhibitor購自銳博生物公司。免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物公司。NF-κB p65兔單克隆抗體、HRP 標(biāo)記馬抗鼠 IgG 二抗購自于美國Cell Signaling公司。Bax兔單克隆抗體、Bcl-2兔單克隆抗體、TLR4兔多克隆抗體購自美國Abcam公司。β-actin鼠單克隆一抗購自武漢Proteintech公司。HRP 標(biāo)記羊抗兔 IgG 二抗購自北京全式金公司。

1.2 小鼠DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型的建立

14只FVB非轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為control組(n=6)，DSS組(n=8)，16只FVB miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為miR-31過表達(dá)組(n=8)，miR-31過表達(dá)+DSS組(n=8)，造模開始前稱重并標(biāo)記所有小鼠。造模周期為5周，造模期間小鼠均進(jìn)食高鐵飼料并飲用無菌水或1%DSS水，具體為control組和miR-31過表達(dá)組造模期間均飲用正常無菌水，DSS組和miR-31+DSS組小鼠第一周飲用1%DSS水，第二周飲用正常無菌水，第三周飲用1%DSS水，且每隔2 d換一次1%DSS水，確保飲用水的干凈與充足，如此循環(huán)5周后造模完成，然后小鼠稱重，安樂死，摘取小鼠結(jié)腸縱向切開，4%的多聚甲醛固定24 h后卷成瑞士卷，隨后進(jìn)行石蠟包埋、切片和HE染色[6]。結(jié)腸組織出現(xiàn)明顯縮短、粘膜增厚，結(jié)腸切片HE染色出現(xiàn)杯狀細(xì)胞和隱窩缺失及淋巴結(jié)腫大為模型成功。剩余結(jié)腸組織立即-80℃保存?zhèn)溆?。通過Western blot和IHC檢測NF-κB、TLR4、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)以及通過TUNEL檢測小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞的凋亡。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人腸上皮細(xì)胞系HCT 116細(xì)胞用含有10%的胎牛血清和含1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基于37℃并含有5% CO2的孵箱中進(jìn)行培育，取對數(shù)生長期的細(xì)胞在六孔板中進(jìn)行接種，并分別標(biāo)記control組、mimic組和inhibitor組，每組均設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，然后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染hsa-miR-31-5p的mimic和inhibitor，十字搖勻后將細(xì)胞置于CO2孵箱中孵育，48 h后收取細(xì)胞并通過Western blot檢測NF-κB、TLR4蛋白的表達(dá)。

1.4 Western blot檢測NF-κB p65、TLR4、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)

收取六孔板中已經(jīng)轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞或取小鼠結(jié)腸組織約50 mg，使用RIPA/PMSF裂解液裂解蛋白，BCA法測定蛋白濃度。總蛋白20 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后使用半干法將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后用5%的脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，TBST洗膜后分別用NF-κB p65一抗(1∶1 000)、TLR4一抗(1∶500)、Bax一抗(1∶2 000)、Bcl-2(1∶2 000)、β-actin一抗(1∶5 000)等于搖床室溫孵育1 h后4℃過夜，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶2 000)或兔抗小鼠IgG(1∶2 000)二抗，室溫孵育1 h，洗膜，將膜放入ChemicDocTMMP,滴加ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影。Image Lab分析Western blot條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白在各組的表達(dá)量。

1.5 免疫組織化學(xué)(IHC)法檢測NF-κB p65、TLR4、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)

將5 μm的結(jié)腸組織石蠟切片置于65℃烘箱中烤30 min，常規(guī)脫蠟復(fù)水，PBS沖洗后用EDTA抗原修復(fù)液在98℃水浴鍋中修復(fù)抗原20 min，PBS沖洗，滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑消除內(nèi)源性過氧化物酶，分別加NF-κB一抗(1∶600)、TLR4一抗(1∶500)、Bax一抗(1∶500)、Bcl-2一抗(1∶500)，陰性對照用PBS代替一抗，放入4℃冰箱過夜。加反應(yīng)增強(qiáng)液室溫避光反應(yīng)30 min，PBS沖洗后滴加增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫孵育1 h，DAB染色，之后進(jìn)行蘇木素復(fù)染，脫水透明，最后中性樹脂封片。將染色強(qiáng)度和染色范圍計(jì)數(shù)結(jié)果的乘積作為免疫組化的評分結(jié)果[7]。

1.6 原位末端轉(zhuǎn)移酶 ( TUNEL) 法檢測小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡

將5 μm的結(jié)腸組織石蠟切片置于65℃烘箱中烤30 min，常規(guī)脫蠟復(fù)水，EDTA抗原修復(fù)液在98℃水浴鍋中修復(fù)抗原20 min，Proteinase K工作液37℃進(jìn)行通透，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑避光封閉，陽性片滴加DNase Ⅰ反應(yīng)30 min，滴加TdT酶反應(yīng)液避光孵育(陰性片不計(jì)入)，Streptavidin-HRP避光反應(yīng)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，最后中性樹脂封片。凋亡細(xì)胞核呈棕褐色顆粒，每張片子隨機(jī)選取五個(gè)區(qū)域，在高倍鏡(×400)下計(jì)算每個(gè)區(qū)域的凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)。凋亡細(xì)胞指數(shù)(apoptotic index，AI)=視野中凋亡細(xì)胞數(shù)/視野中細(xì)胞總數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測miR-31對小鼠結(jié)腸組織中NF-κB和TLR4蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果表明，與control組相比，DSS組NF-κB (P<0.01，圖1A，表1)、TLR4(P<0.01，圖1B，表1)蛋白表達(dá)顯著升高，miR-31組NF-κB(P<0.05，圖1A，表1)、TLR4(P<0.05，圖1B，表1)蛋白表達(dá)也顯著升高；同樣的與DSS組相比，miR-31+DSS組NF-κB(P<0.01，圖1A，表1)、TLR4(P< 0.01，圖1B，表1)蛋白的表達(dá)也顯著升高。說明miR-31對結(jié)腸炎的促進(jìn)作用與TLR4/NF-κB通路有關(guān)。

Fig. 1 Relative expressions of NF-κB and TLR4 in mouse colon

2.2 免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測miR-31對小鼠結(jié)腸組織中NF-κB和TLR4蛋白表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果表明，與control組相比，DSS組NF-κB (P<0.01，圖2，表2)、TLR4(P<0.01，圖2，表2)蛋白表達(dá)顯著升高，miR-31組NF-κB(P< 0.01，圖2，表2)、TLR4(P<0.01，圖2，表2)蛋白表達(dá)也顯著升高； 同樣的與DSS組相比，miR-31+DSS組NF-κB(P<0.01，圖2，表2)、TLR4(P<0.01，圖2，表2)蛋白的表達(dá)也顯著升高。進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-31對結(jié)腸炎的促進(jìn)作用與TLR4/NF-κB通路有關(guān)(圖2見彩圖頁Ⅰ)。

Tab. 1 Relative expressions of NF-κB, TLR4, Bcl-2/Bax ratioin and apoptotic index in mouse colon

Tab. 2 Relative expressions of NF-κB, TLR4, Bax, Bcl-2 in mouse colon by IHC

2.3 Western blot檢測miR-31對小鼠結(jié)腸組織中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

小鼠結(jié)腸組織Western blot結(jié)果表明，與control組相比，DSS組 (P<0.01)和miR-31組(P<0.05) Bcl-2/Bax的表達(dá)顯著降低；與DSS組相比，miR-31+DSS組的Bcl-2/Bax表達(dá)也顯著降低(P<0.01，圖3，表1)。說明miR-31過表達(dá)會(huì)增加結(jié)腸炎組織的細(xì)胞凋亡。

Fig. 3 Relative expressions of Bcl-2 and Bax in colonic tissue of mice

2.4 免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測miR-31對小鼠結(jié)腸組織中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果表明，與control組相比，DSS組Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01，圖4A，表2)、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01，圖4B，表2)，miR-31組Bax蛋白表達(dá)顯著升高 (P<0.05，圖4A，表2)、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01，圖4B，表2)； 與DSS組相比，miR-31+DSS組Bax蛋白表達(dá)顯著升高 (P<0.01，圖4A，表2)、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01，圖4B，表2)。進(jìn)一步證實(shí)miR-31過表達(dá)會(huì)使結(jié)腸炎組織的細(xì)胞凋亡增加(圖4見彩圖頁Ⅱ)。

2.5 TUNEL法檢測miR-31對小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL結(jié)果顯示，與control組相比，DSS組(P<0.01)和miR-31組(P<0.05)凋亡細(xì)胞均顯著增加，核固縮，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)棕褐色；與DSS組相比，miR-31+DSS組棕褐色的凋亡細(xì)胞也顯著增加(P<0.01，圖5，表1，圖5見彩圖頁Ⅲ)。

2.6 miR-31對HCT 116細(xì)胞中NF-κB、TLR4蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)腸炎中miR-31對TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響，我們使用miR-31的mimic和Inhibitor轉(zhuǎn)染HCT 116細(xì)胞。Western blot結(jié)果表明，與control組相比，轉(zhuǎn)染miR-31-mimic后，NF-κB (P<0.05，圖6A，表3)、TLR4(P<0.01，圖6B，表3)蛋白表達(dá)顯著升高，轉(zhuǎn)染miR-31-Inhibitor后NF-κB(圖6A，表3)、TLR4(P<0.05，圖6B，表3)蛋白表達(dá)降低，與小鼠結(jié)腸組織的結(jié)果一致。

Fig. 6 Relative expressions of NF-κB and TLR4 in HCT 116 cells after miR-31 overexpression or knock-down

Tab. 3 Relative expressions of NF-κB and TLR4 in HCT 116 cells after miR-31 overexpression or knock-down

3 討論

近年來miRNAs被用作生物標(biāo)志物或治療靶標(biāo)備受關(guān)注，目前已有許多研究已經(jīng)表明miRNAs與腫瘤、炎癥性疾病、心臟疾病等多種疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，如miR-31在喉鱗狀細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌和結(jié)直腸癌中均有miRNAs的異常表達(dá)[8-12]。我們實(shí)驗(yàn)室前期通過對潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸組織miRNAs篩選發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比miR-31-5p有顯著性差異性表達(dá)且目前研究較少，因此我們把miR-31作為本課題深入研究潰瘍性結(jié)腸炎的靶標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)室利用DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型已有多年且技術(shù)十分成熟[13,14]，前期的結(jié)果也已經(jīng)證明miR-31過表達(dá)的小鼠DSS誘導(dǎo)腸炎發(fā)生率和炎癥程度均高于非轉(zhuǎn)基因小鼠，說明miR-31過表達(dá)促進(jìn)腸炎的發(fā)生[6]，故適度抑制miR-31是否可以治療腸炎也是我們關(guān)注的問題。本研究則在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)miR-31過表達(dá)會(huì)使?jié)冃越Y(jié)腸炎小鼠組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)升高以及使凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax比值下降，提示miR-31對結(jié)腸炎的促進(jìn)作用與TLR4/NF-κB信號(hào)通路以及細(xì)胞凋亡相關(guān)。

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是由多種因素引起的慢性復(fù)雜疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，因此受到越來越多的關(guān)注[1]。IBD期間炎癥介質(zhì)(包括促炎細(xì)胞因子)的過量產(chǎn)生可能促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展，據(jù)報(bào)道，炎癥過程中的幾個(gè)關(guān)鍵因子如NF-κB與炎癥和癌癥之間的轉(zhuǎn)換機(jī)制有關(guān)[15-17]。有研究表明，TLRs和TNFR的激活會(huì)導(dǎo)致NF-κB的活化并誘導(dǎo)許多促炎因子的表達(dá)，例如誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)[18-20]，且越來越多的研究報(bào)道TLR4 / NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)在結(jié)腸炎及其相關(guān)結(jié)腸癌中的關(guān)鍵性作用[16,21]，但目前對于結(jié)腸炎中miR-31與TLR4 / NF-κB之間的關(guān)系研究較少。我們的結(jié)果表明，在小鼠的結(jié)腸組織中，DSS誘發(fā)腸炎小鼠結(jié)腸TLR4、NF-κB的蛋白表達(dá)顯著升高，同時(shí)miR-31組TLR4、NF-κB的蛋白表達(dá)水平也比正常對照組增加；與DSS組相比，miR-31+DSS組TLR4、NF-κB的蛋白表達(dá)水平也顯著升高。提示miR-31對結(jié)腸炎的促進(jìn)作用與TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們的推斷，我們在HCT 116細(xì)胞中分別過表達(dá)和抑制miR-31-5p，結(jié)果表明，miR-31-5p過表達(dá)組TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)升高，miR-31-5p 敲低組TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平相比于正常對照組下降。這些結(jié)果提示適度抑制miR-31可以通過下調(diào)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的活性對結(jié)腸炎發(fā)揮治療作用，但其詳細(xì)的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡增加在UC發(fā)病中起重要作用[22]，Bax可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2是細(xì)胞凋亡抑制基因，增加Bcl-2的表達(dá)可以與Bax結(jié)合形成更穩(wěn)定的異二聚體以抑制細(xì)胞凋亡，因此Bcl-2 / Bax的比例可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[23]。而在本次研究中我們觀察到，在小鼠的結(jié)腸組織中，相比于正常對照組，DSS組和miR-31組Bax蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降，Bcl-2/Bax的比值下降；同樣的與DSS組相比，miR-31+DSS組Bax蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降，Bcl-2/Bax的比值下降。同樣的，通過原位末端轉(zhuǎn)移酶 (TUNEL) 法我們還觀察到潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型中存在大量凋亡的細(xì)胞核，且miR-31過表達(dá)會(huì)使小鼠結(jié)腸組織凋亡的細(xì)胞核增加。這些結(jié)果表明，miR-31可以通過介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells, IEC)的凋亡來促進(jìn)結(jié)腸炎，但具體的凋亡途徑仍然需要進(jìn)一步探究。

綜上所述，miR-31可以促進(jìn)潰瘍性結(jié)腸炎期間TLR4、NF-κB蛋白的表達(dá)，并使Bcl-2/Bax的表達(dá)在潰瘍性結(jié)腸炎組織中降低，同時(shí)miR-31過表達(dá)使?jié)冃越Y(jié)腸炎組織中細(xì)胞凋亡增加，提示我們miR-31對潰瘍性結(jié)腸炎的促進(jìn)作用與TLR4/NF-κB信號(hào)通路和凋亡相關(guān)，為潰瘍性結(jié)腸炎的治療提供新的思路和靶點(diǎn)，但其具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。