外源性精胺對(duì)糖尿病腎病小鼠腎纖維化的影響及其機(jī)制*

邵小婷，扈 敬，張欣穎，趙冰冰，李思葳，高 萍，徐長(zhǎng)慶，魏 璨△

(1. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 病理生理學(xué)教研室，2. 附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150086)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病重要的微血管并發(fā)癥之一。隨著糖尿病發(fā)病率逐年上升，DN已是全球性慢性腎功能衰竭(終末期腎病)的首要原因。DN 診療費(fèi)用較高，引起社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)逐年增加；且 DN 發(fā)病機(jī)制尚未清晰闡明，亦缺乏有效的治療方法。因此，進(jìn)一步揭示 DN 的發(fā)病機(jī)制及其防治措施已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[1]。

目前，DN 的發(fā)病機(jī)制主要涉及基因突變、糖代謝、血流動(dòng)力學(xué)紊亂、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、免疫炎癥反應(yīng)[2]。腎纖維化是 DN引起腎功能衰竭的主要途徑。糖尿病腎臟的形態(tài)學(xué)改變(細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度生成、沉積和腎小球基底膜的增厚)與腎功能降低密切相關(guān)。報(bào)道指出，膠原和纖維連接蛋白是腎小球的主要基質(zhì)蛋白，其在系膜細(xì)胞中的顯著增加可導(dǎo)致腎小球纖維化和硬化[3]。因此，進(jìn)一步揭示腎纖維化的發(fā)生機(jī)制并尋求有效的治療靶點(diǎn)，成為研究者的關(guān)注點(diǎn)。

多胺(包括精胺，精脒和腐胺)，是廣泛存在于自然界中的多價(jià)陽(yáng)離子烷基胺，參與細(xì)胞增殖、分化與凋亡的調(diào)控，其代謝紊亂參與糖尿病，中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變和缺血性疾病的發(fā)生發(fā)展[4, 5]。本課題組前期研究證實(shí)，糖尿病心肌病大鼠多胺代謝紊亂，內(nèi)源性精胺減少，進(jìn)一步觸發(fā)鈣穩(wěn)態(tài)失衡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激，引起心肌損傷；給予外源性精胺有明顯心肌保護(hù)作用[6, 7]。但是，多胺(精胺)在 DN 中的作用尚未完全闡明。本文在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，探討外源性精胺能否通過(guò)抑制腎纖維化對(duì)糖尿病腎病發(fā)揮保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及模型復(fù)制

24只雄性 C57 小鼠(18～25 g，購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周，自由進(jìn)行飲食和飲水。之后，隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組(Control)，糖尿病組(T1D)，精胺預(yù)處理組(T1D+Sp)。采用 60 mg/kg STZ(溶于0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)一次性腹腔注射，復(fù)制 1 型糖尿病模型；Control 組及模型組注射相同體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；T1D+Sp 組 STZ 注射前連續(xù)兩周每天腹腔注射精胺(5 mg/(kg·d))，隨后隔天注射精胺至 12 周。實(shí)驗(yàn)小鼠注射 STZ 前禁食 12 h，注射后立即喂 10% 葡萄糖水溶液 24 h。注射 STZ 3 d后，小鼠尾動(dòng)脈采血測(cè)空腹血糖(FBG)，以FBG≥ 16.7 mmol/L認(rèn)為是小鼠糖尿病模型成功。其間，每周測(cè)量小鼠血糖與體重的變化。12 周后，整晚禁食，摘眼取血后，腹腔注射戊巴比妥鈉 30 mg/kg 麻醉并處死各組小鼠。血樣收集到含有抗凝劑的采樣管中，離心，取血清用于其他指標(biāo)的檢測(cè)。摘除小鼠腎臟，一部分用 4% 多聚甲醛固定，用于HE、PAS等染色；一部分凍于 -80℃，用于免疫印跡等檢測(cè)。根據(jù)小鼠肌酐、尿素氮值的變化判斷是否成為 DN 模型。

1.2 糖尿病大鼠血糖、體重、肌酐、尿素氮水平的變化

小鼠造模成功后，在第 0 周和第12周時(shí)，分別記錄每只小鼠的體重、血糖。處死小鼠后，檢測(cè)血清肌酐、尿素氮含量。

1.3 腎臟組織HE、PAS染色

開(kāi)腹摘取小鼠右側(cè)腎臟，分離皮、髓質(zhì)，取少量腎皮質(zhì)用 4% 多聚甲醛固定 48 h，酒精脫水，二甲苯透明，石蠟浸潤(rùn)包埋，切片機(jī)切成 2～3 μm 的薄片，切片相繼進(jìn)行 45℃ 恒溫箱烘干，二甲苯脫蠟，酒精逐級(jí)脫水染色。

HE染色：蘇木精溶液染色 5 min，流水洗 1～3 s，1% 鹽酸酒精和 1% 氨水酒精各數(shù)秒鐘，蒸餾水沖洗后 1% 伊紅染色 3 min，經(jīng)梯度酒精脫水后，二甲苯使切片透明后中性樹(shù)膠封片。

PAS染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗 2 min，1% 過(guò)碘酸水溶液氧化 10 min，自來(lái)水洗 2 min，蒸餾水洗 2 min，入 Schiff 試劑反應(yīng) 15 min，流水沖洗 10 min，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核 1 min，自來(lái)水洗 5～10 min，1% 鹽酸乙醇分化 3～5 s，自來(lái)水沖洗至返藍(lán)，脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.4 腎臟組織Masson染色

切片至脫蠟至水(二甲苯兩遍，各15 min；無(wú)水乙醇兩遍。95% 乙醇、80% 乙醇各 5 min)。蘇木素染 5～10 min，鹽酸酒精分化，流水藍(lán)化，蒸餾水洗。麗春紅酸性品紅液染5 min，蒸餾水洗三遍至浮色脫去，1% 磷鉬酸水溶液處理 3 min，不用水洗直接用亮綠液復(fù)染 3 min，蒸餾水沖洗三遍至浮色脫去，0.2%冰醋酸處理三遍，無(wú)水乙醇快速脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封固。

1.5 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況

取冷凍腎臟組織標(biāo)本，在冰上經(jīng)勻漿器充分研磨，加入含有PSMF的裂解液充分裂解組織勻漿，4℃、13 500 r/min 離心機(jī)離心 30 min后，留取上清，進(jìn)行 BCA 定量，測(cè)定各組蛋白濃度。之后加入一定體積的loading buffer后，樣品在沸水中煮 10 min，使蛋白充分變性。用 SDS-PAGE 分離蛋白，完畢后采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，用脫脂奶粉封閉 1 h 后，TBST 洗三遍，特異性一抗(1∶1 000)4℃過(guò)夜，去一抗，TBST 洗三遍，然后加入稀釋過(guò)的二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，去二抗，TBST 洗三次。ECL 法進(jìn)行顯色。應(yīng)用 Image J 圖像處理軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，測(cè)量灰度值，計(jì)算各組目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果以 MMP-2、MMP-9、Coll-IV 與 β-actin 的比值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般狀態(tài)和腎功能相關(guān)指標(biāo)變化

小鼠造模成功后第 12 周檢測(cè)指標(biāo)顯示：與 Control 組相比，T1D 組小鼠體重明顯下降，血糖、肌酐、尿素氮明顯升高，說(shuō)明糖尿病小鼠出現(xiàn)明顯腎功能降低，給予外源性精胺預(yù)處理，可明顯改善上述情況(表1)。

Tab. 1 Comparison of blood glucose, body weight, Cre and BUN in each group n=8)

2.2 各組小鼠腎組織病理學(xué)改變

Control組結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變，T1D 組細(xì)胞外基質(zhì)明顯增多，系膜區(qū)明顯擴(kuò)大，基底膜增厚。與 T1D 組相比，T1D+Sp 組上述病理改變明顯改善，細(xì)胞外基質(zhì)輕度增生(圖1)。

Fig. 1 Pathological changes of renal issue at the end of the 12th week

2.3 各組小鼠腎組織中膠原的含量變化

Masson染色結(jié)果顯示，Control 組小鼠腎組織細(xì)胞間隙清晰可見(jiàn)，腎間質(zhì)膠原纖維分布極少，染色較淡。T1D 組小鼠腎小球系膜基質(zhì)增多，腎間質(zhì)膠原組織增多，細(xì)胞間質(zhì)有明顯藍(lán)色深染的膠原纖維。與T1D 組相比，T1D+Sp 組小鼠腎組織膠原染色則明顯減少(圖2)。

Fig. 2 Pathological changes of renal issue at the end of the 12th week(Masson staining)

2.4 各組小鼠腎纖維化相關(guān)蛋白變化

分別以 MMP-2、MMP-9 和Coll-IV 與 β-actin的比值作為分析參數(shù)。與 Control 組相比：T1D 組 MMP-2、MMP-9 和 Coll-IV 的表達(dá)量均明顯升高；與 T1D 組相比：T1D+Sp 組 MMP-2、MMP-9 和 Coll-IV的表達(dá)量均明顯下降(圖3，表2)。

Fig. 3 Comparison of fibrosis related protein in renal tissue

Tab. 2 Comparison of fibrosis related protein expressions in each group n=4)

3 討論

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由胰島素分泌不足、胰島素抵抗或兩者兼有而引起的以高血糖為特征的慢性代謝性疾病，嚴(yán)重危害患者身體健康和生活質(zhì)量。長(zhǎng)期的高血糖可導(dǎo)致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙，具有較高的致死性[8]。

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的慢性微血管并發(fā)癥之一，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，其早期病理特征為腎小球肥大和腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)增厚以及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix ，ECM)合成增多；后期表現(xiàn)為腎小球和腎小管纖維化，最終引起腎纖維化和腎功能衰竭[9, 10]。

腎臟是機(jī)體重要的排泄器官，通過(guò)排除代謝廢物、毒物和藥物，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。血清肌酐和尿素均屬于需經(jīng)腎臟排除的非蛋白氮(non protein nitrogen，NPN)，其含量升高反映腎臟排除代謝廢物的能力降低[10]。本文采用一次性注射 STZ 的方法復(fù)制 1 型糖尿病小鼠模型。結(jié)果顯示，模型組小鼠血糖顯著升高，體重明顯減輕，小鼠糖尿病模型成功復(fù)制；同時(shí)，模型組血清肌酐、尿素氮明顯升高，表明模型組小鼠發(fā)生了腎功能不全，發(fā)展為糖尿病腎病。

本研究結(jié)果表明，糖尿病大鼠多胺代謝紊亂，內(nèi)源性精胺含量減低；給予外源性精胺可以減輕鈣穩(wěn)態(tài)失衡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激所引起心肌損傷[6,7]。近來(lái)，本課題組也在糖尿病腎組織中觀察到鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase，ODC，多胺合成關(guān)鍵酶)表達(dá)減少，而精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶(spermidine / spermine N1-acetyltransferase，SSAT，多胺降解關(guān)鍵酶)表達(dá)增加，這提示內(nèi)源性精胺減少。鑒此，本研究在正常組和糖尿病組的基礎(chǔ)上，增加外源性精胺預(yù)處理組，探討外源性精胺能否通過(guò)抑制腎纖維化對(duì)糖尿病腎病發(fā)揮保護(hù)作用。

為了初步探討 1 型糖尿病小鼠 DN 的發(fā)生機(jī)制，本研究采用 HE、PAS 和 Masson 染色光鏡觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化和腎組織膠原纖維沉積水平。HE 染色是腎臟形態(tài)學(xué)檢查中常用的染色方法，有助于評(píng)估腎小球的完整性，例如，系膜細(xì)胞的增生情況和硬化程度，以及間質(zhì)浸潤(rùn)程度等；PAS 染色亦稱(chēng)為糖原染色，其原理是糖原、糖蛋白和糖脂中羥基的氧化，因?yàn)檫@些碳水化合物常見(jiàn)于基底膜，因此 PAS 染色有助于判斷腎小球基底膜的厚度增加；Masson 染色是針對(duì)膠原的特殊染色方法，多用于觀察腎間質(zhì)纖維化的情況。結(jié)果顯示，與 Control 組相比，T1D 小鼠腎小球基底膜增厚，細(xì)胞基質(zhì)增多，膠原明顯增加，表明腎小球發(fā)生了纖維化和硬化，精胺預(yù)處理可明顯減輕上述損傷。

為揭示精胺對(duì) DN 保護(hù)作用的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和膠原的含量變化。MMPs是 ECM 蛋白水解酶，通過(guò)降解基質(zhì)膠原在調(diào)節(jié)細(xì)胞外環(huán)境中發(fā)揮重要作用[11]。MMP-2 和MMP-9 是降解 IV 型膠原(Coll-IV，GBM的主要成分)的明膠酶，對(duì)維持 GBM 的完整性至關(guān)重要[12]。已有文獻(xiàn)報(bào)道 MMP的失調(diào)參與腎纖維化的發(fā)生[13]。Western blot 結(jié)果提示，T1D 組小鼠腎臟組織中 MMP-2、MMP-9 和 Coll-IV 蛋白的表達(dá)均顯著升高，而外源性精胺明顯下調(diào)上述蛋白的表達(dá)。也就是說(shuō)，ECM 的產(chǎn)生和降解異常激活是腎小球纖維化的重要機(jī)制，外源性精胺通過(guò)恢復(fù) ECM 調(diào)節(jié)系統(tǒng)(MMP/TIMP)的穩(wěn)態(tài)，抑制系膜基質(zhì)蓄積和纖維化，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

綜上所述，多胺穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致的 MMPs 異常激活和膠原過(guò)度沉積是 DN 小鼠腎纖維化的重要機(jī)制，外源性精胺預(yù)處理通過(guò)調(diào)節(jié) MMPs 與膠原之間的平衡，減輕腎纖維化，改善腎功能，這為糖尿病腎病的預(yù)防提供了新思路。