凍融周期不同囊胚移植策略的臨床結(jié)局比較

王慧 劉帥 楊麗 馬才啟 武慧姣

廣州市婦女兒童醫(yī)療中心（廣州510623）

凍融胚胎移植（freezing embryo transfer，F(xiàn)ET）作為一種衍生的輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART），因其可增加累計妊娠率、降低ART的并發(fā)癥，并可獲得與新鮮胚胎移植相近的臨床結(jié)局，已被廣泛接受和應(yīng)用[1-2]。囊胚是胚胎發(fā)育的重要階段，囊胚培養(yǎng)可以淘汰掉一些發(fā)育潛能差和染色體異常的胚胎，因此囊胚移植較卵裂期胚胎移植有更好的妊娠結(jié)局[3-6]。在凍融周期進(jìn)行囊胚移植已成為許多中心的常規(guī)移植策略。目前有部分患者選擇直接凍融囊胚移植，另有部分患者是將卵裂期胚胎凍融后再培養(yǎng)至囊胚進(jìn)行移植，這兩種策略哪種更優(yōu)目前還沒有定論。毛佳婷等[7-8]認(rèn)為直接凍融囊胚有更高的種植率和妊娠率，但王大琳等[9]表明凍融卵裂期胚胎再培養(yǎng)至囊胚移植的妊娠結(jié)局會更好。此外，在將卵裂期胚胎凍融后再行囊胚培養(yǎng)時，有部分患者會出現(xiàn)凍融周期沒有可利用囊胚形成但有低質(zhì)量囊胚形成的情況。醫(yī)學(xué)上是否可以為患者移植低質(zhì)量囊胚有待探討。本研究對本院生殖中心2015年7月至2019年7月完成的791個囊胚移植周期進(jìn)行回顧性分析，比較直接凍融可利用囊胚與凍融卵裂期胚胎再培養(yǎng)至可利用囊胚移植在臨床妊娠結(jié)局方面的差異，同時也比較凍融卵裂期胚胎培養(yǎng)至可利用囊胚和低質(zhì)量囊胚移植的差異，旨在為患者提供更為合適的囊胚移植策略。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2015年7月至2019年7月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心生殖醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行凍融周期囊胚移植的791個周期，其中直接凍融可利用囊胚移植組（A組）372個周期，凍融卵裂期胚胎再培養(yǎng)至可利用囊胚移植組（B組）261個周期，凍融卵裂期胚胎培養(yǎng)至低質(zhì)量囊胚移植組（C組）158個周期。所有患者均簽署囊胚培養(yǎng)知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 促排卵及囊胚培養(yǎng)所有研究對象采用的促排卵方案均按本中心常規(guī)進(jìn)行，獲卵后根據(jù)患者情況采用常規(guī)IVF 授精或行單精子卵胞漿注射，本研究不包括行胚胎植入前診斷的患者。在受精后第3天進(jìn)行胚胎評分。除了移植胚胎外，剩余胚胎經(jīng)患者知情同意后有些行全部卵裂期胚胎冷凍；有些行全部囊胚培養(yǎng)；還有些患者挑選部分胚胎冷凍，剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)，第5-6天將發(fā)育成可利用囊胚的胚胎進(jìn)行冷凍保存。

1.2.2 囊胚評分系統(tǒng)本中心采用Gardner 評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行囊胚評估[10]：根據(jù)囊腔擴(kuò)張程度分為6個時期。Ⅰ期：早期囊腔不超過囊胚總體積的1/2；Ⅱ期：囊腔體積超過囊胚總體積的1/2；Ⅲ期：囊腔全占據(jù)整個囊胚；Ⅳ期：囊腔繼續(xù)擴(kuò)張，透明帶變??；Ⅴ期：部分囊胚從透明帶中孵出；Ⅵ期：囊胚完全孵出。處于Ⅲ-Ⅵ期的囊胚根據(jù)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞質(zhì)量進(jìn)行分級。（1）內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分級：A級細(xì)胞排列緊密且數(shù)量多，B級細(xì)胞排列松散且數(shù)量較少，C級細(xì)胞數(shù)量很少。（2）滋養(yǎng)層細(xì)胞分級：A級上皮細(xì)胞層結(jié)構(gòu)致密且有較多細(xì)胞，B級上皮細(xì)胞層結(jié)構(gòu)松散且細(xì)胞不多，C級上皮細(xì)胞層由稀疏細(xì)胞組成。冷凍囊胚的標(biāo)準(zhǔn)：將D5評分＞ⅢCC、D6評分＞ⅣCC 定義為可利用囊胚，將未達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)的囊胚定義為低質(zhì)量囊胚。

1.2.3 胚胎的冷凍與復(fù)蘇（1）D3卵裂期胚胎及囊胚的玻璃化冷凍。本中心常規(guī)使用JY-V（加拿大JY公司）玻璃化冷凍液進(jìn)行卵裂期胚胎和囊胚的冷凍。JY-V 包括平衡液（V1），玻璃化冷凍液（V2），先放于室溫平衡。將可利用囊胚在冷凍前利用激光輔助孵化系統(tǒng)（300 μs）在遠(yuǎn)離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)一側(cè)透明帶進(jìn)行人工皺縮囊腔，將囊胚液釋放，囊腔縮小，隨后將皺縮后的囊胚轉(zhuǎn)移至V1液中平衡5～7 min，D3卵裂期胚胎則直接在V1液平衡3～5 min，然后轉(zhuǎn)移至在V2 冷凍液中1 min 即開始裝管，每次放1～2個胚胎。將胚胎放在載體的最前端1～2 mm 處，套上外套管，將載體完全浸入液氮中，將冷凍載桿裝入冷凍套管液氮儲存。從裝管開始至放入液氮中需要在2 min 操作完成。（2）D3卵裂期胚胎及囊胚的玻璃化解凍。本中心常規(guī)使用JY-T 玻璃化解凍液進(jìn)行卵裂期胚胎和囊胚的解凍。JY-T 包括解凍液T1，稀釋液T2，稀釋液T3，沖洗液T4，先放于室溫平衡。從液氮中取出冷凍載桿后迅速浸入T1液中，顯微鏡下見胚胎后將載桿（medicult 管）移出，胚胎停留1 min后，先后移入T2液3 min、T3液3 min、T4液3 min，最后將胚胎移入囊胚培養(yǎng)液（G2 vitrolife公司），放入37℃，6%CO2培養(yǎng)箱中。囊胚復(fù)蘇成功2 h后可用于移植，D3卵裂期胚胎復(fù)蘇后需培養(yǎng)至D5或D6 形成囊胚后可用于移植。

1.2.4 囊胚移植將復(fù)蘇后存活的囊胚或復(fù)蘇D3胚胎行囊胚培養(yǎng)后形成的囊胚進(jìn)行移植，囊胚移植28 d后，腹部B 超下見妊娠囊及原始心管搏動確定臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的定量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本情況凍融可利用囊胚組（A組）和凍融卵裂期胚胎再培養(yǎng)至可利用囊胚組（B組）患者的平均年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、基礎(chǔ)FSH、不孕年限及內(nèi)膜厚度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；但B組平均移植胚胎數(shù)比A組多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。A組平均移植囊胚數(shù)為1.68個，B組平均移植囊胚數(shù)為1.82個。

凍融卵裂期胚胎培養(yǎng)至可利用囊胚組（B組）和凍融卵裂期胚胎培養(yǎng)至低質(zhì)量囊胚（C組）患者的BMI、基礎(chǔ)FSH、不孕年限、內(nèi)膜厚度及移植胚胎數(shù)比較，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；但C組的平均年齡比B組大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 患者臨床妊娠結(jié)局凍融可利用囊胚組（A組）有372個周期獲得可利用囊胚，共移植囊胚624枚。凍融卵裂期胚胎再培養(yǎng)至可利用囊胚移植組（B組）有261個周期，共移植囊胚474枚，獲得妊娠周期157個，共225枚胚胎成功著床。B組同A組相比，臨床妊娠率、種植率、流產(chǎn)率及宮外孕率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，但B組多胎率高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

凍融卵裂期胚胎再培養(yǎng)至低質(zhì)量囊胚移植（C組）有158個周期，共移植胚胎277枚。獲得妊娠周期76個，共89枚胚胎成功著床。C組同B組的臨床妊娠率、種植率及多胎率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1 各組不孕患者基本情況比較Tab.1 Comparison of demographic characteristics of the patients in different groups ±s

表1 各組不孕患者基本情況比較Tab.1 Comparison of demographic characteristics of the patients in different groups ±s

注：t1、P1代表A組和B組之間的比較；t2、P2代表B組和C組之間的比較

指標(biāo)平均年齡（歲）體質(zhì)量指數(shù)（kg/m2）基礎(chǔ)FSH（IU/L）不孕年限（年）內(nèi)膜厚度（mm）移植胚胎數(shù)（個）A組（n=372）31.48±4.32 21.19±2.86 5.73±1.67 2.93±2.34 9.81±1.72 1.68±0.47 B組（n=261）31.40±4.66 21.20±2.96 5.48±1.60 3.00±2.69 9.66±1.63 1.82±0.43 C組（n=158）32.88±5.22 21.52±2.88 5.58±1.33 3.49±2.57 9.71±1.49 1.75±0.49 t1值0.23 0.03 1.90 0.31 1.12 3.85 P1值0.82 0.97 0.06 0.76 0.26＜0.001 t2值2.94 1.07 0.65 1.86 0.33 1.34 P2值＜0.01 0.28 0.51 0.06 0.74 0.18

表2 各組患者囊胚移植的臨床結(jié)局比較Tab.2 Comparison of pregnancy outcomes of the patients in different groups

3 討論

ART 中，冷凍保存人類胚胎已成為臨床實(shí)踐中的常規(guī)程序。在卵巢過度刺激綜合征或其他原因不宜進(jìn)行新鮮胚胎移植的情況下，可以選擇冷凍所有可用的胚胎以后再進(jìn)行解凍移植[11]。在全球范圍內(nèi)，F(xiàn)ET的應(yīng)用在過去幾年中一直在不斷增加，目前占所有胚胎移植的50%以上[12-13]。受精卵在受精后第3天（D3）進(jìn)行冷凍保存是從早年到最近的臨床實(shí)踐中最常用的方法。近年來，隨著序貫培養(yǎng)體系的不斷完善，人類囊胚形成率及質(zhì)量得到了改善，囊胚培養(yǎng)變得相對成熟。培養(yǎng)至第5天（D5）和第6天（D6）的囊胚在形態(tài)上經(jīng)歷了細(xì)胞的融合、囊胚腔的形成和囊胚腔擴(kuò)張的過程，可淘汰一些發(fā)育潛能不好及染色體異常的胚胎，提高了臨床妊娠率和活產(chǎn)率[14-15]，而且囊胚與子宮內(nèi)膜之間有更好的時間同步性，使其有更高的著床率，移植的胚胎數(shù)可能減少，并因此降低了多胎妊娠的風(fēng)險[16-17]。因此，越來越多的患者愿意接受體外培養(yǎng)至囊胚再行可用囊胚的凍融移植，這可以避免無效的胚胎移植的情況出現(xiàn)。然而，許多患者在之前的ART 周期中在液氮罐中儲存的大部分是D3卵裂期的胚胎。在這部分患者希望做囊胚移植時，實(shí)驗(yàn)室會將其D3卵裂期胚胎解凍后再培養(yǎng)至囊胚進(jìn)行移植。

在凍融周期中，直接凍融囊胚移植或?qū)⒙蚜哑谂咛鋈诤笤倥囵B(yǎng)至囊胚進(jìn)行移植，哪種方式更為有效，目前還沒有定論。有研究[7-8]認(rèn)為玻璃化冷凍囊胚復(fù)蘇移植能獲得較高的種植率和妊娠率，囊胚可能是玻璃化冷凍胚胎的較好階段；也有結(jié)果[9]表明凍融卵裂期胚胎再培養(yǎng)至囊胚移植組的臨床妊娠率以及胚胎種植率要高于直接凍融囊胚移植組，但兩組臨床妊娠率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究回顧性分析了我院生殖中心2015年7月至2019年7月完成的凍融周期囊胚移植周期，其中凍融可利用囊胚后移植372個周期（A組），凍融卵裂期胚胎再培養(yǎng)至可利用囊胚移植261個周期（B組），筆者將A組和B組的臨床結(jié)局進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示兩組的臨床妊娠率（61.56%vs.60.15%）、移植率（48.40%vs.47.47%）、宮外孕率（2.18%vs.1.91%）及流產(chǎn)率（17.90%vs.12.74%）相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，但B組的多胎率要高于A組（42.68%vs.31.44%）。這可能是由于B組的平均移植囊胚數(shù)（1.82）要高于A組（1.68）。這個結(jié)果也暗示在凍融卵裂期胚胎培養(yǎng)至囊胚移植時，可能是通過增加移植囊胚的數(shù)目才獲得和凍融囊胚移植相似的臨床妊娠率。XIONG 等[18]研究表明，與凍融囊胚移植相比，凍融卵裂期胚胎培養(yǎng)至囊胚移植的臨床妊娠率和種植率略低，但是，早期流產(chǎn)的發(fā)生率也較低，因此兩組的持續(xù)妊娠率和活產(chǎn)率相似。包括性別比、入院新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房（NICU）和出生缺陷在內(nèi)的新生兒結(jié)局也相同。這些發(fā)現(xiàn)表明，解凍卵裂期胚胎培養(yǎng)至囊胚進(jìn)行移植，妊娠結(jié)局和圍產(chǎn)期結(jié)局與直接凍融囊胚移植是相似的，這對于患者來說是可以接受的。在將卵裂期胚胎凍融后再行囊胚培養(yǎng)時，有部分患者會出現(xiàn)這個凍融周期沒有可利用囊胚形成的情況。有研究[19]也指出D3卵裂期胚胎凍融后培養(yǎng)至囊胚移植可以得到較好的臨床結(jié)果，但有無囊胚形成或無可利用囊胚形成而取消移植的風(fēng)險。目前，大部分生殖醫(yī)學(xué)中心評估囊胚采用的是Gardner 囊胚分級系統(tǒng)[10]，基于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、滋養(yǎng)外胚層形態(tài)和擴(kuò)張等級3個參數(shù)。只有D5評分＞ⅢCC、D6評分＞ⅣCC 定義為可利用囊胚。有些患者在凍融周期中，胚胎生長速率較慢，在第5天或第6天雖有囊胚形成，但沒達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)，又不能接受無胚胎移植的情況，患者知情同意后移植了一些發(fā)育速度較慢或質(zhì)量較差的囊胚。這些低質(zhì)量囊胚的臨床結(jié)局如何尚未明確。本研究回顧性分析了凍融卵裂期胚胎再培養(yǎng)至低質(zhì)量囊胚移植158個周期（C組），其中153個周期是D5 移植的Ⅰ期、Ⅱ期早期囊胚。同凍融卵裂期胚胎再培養(yǎng)至可利用囊胚移植（B組）相比，臨床妊娠率（48.10%vs.60.15%）、種植率（32.13%vs.47.47%）和多胎率（15.79%vs.42.68%）差異有統(tǒng)計學(xué)意義，流產(chǎn)率和宮外孕率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。有研究[20-21]認(rèn)為在凍融移植周期，D5囊胚的移植率明顯高于D6的移植率，HUANG等[22]表明延遲發(fā)育的第7天囊胚與第5天、第6天囊胚有相似的圍產(chǎn)期結(jié)局。不同生長速率的囊胚都具有相似的發(fā)育力。本研究發(fā)現(xiàn)低質(zhì)量囊胚對凍融胚胎移植的臨床結(jié)局有負(fù)面影響。由于低質(zhì)量囊胚的種植率和多胎率低，可以適當(dāng)增加移植數(shù)目來保持一定的臨床妊娠率。也有學(xué)者將皺縮囊胚與低質(zhì)量囊胚聯(lián)合復(fù)蘇移植也能獲得不錯的臨床結(jié)局[23]。

筆者在對凍融卵裂期胚胎再培養(yǎng)至可利用囊胚移植組（B組）和凍融卵裂期胚胎再培養(yǎng)至低質(zhì)量囊胚移植組（C組）基礎(chǔ)資料的比較中發(fā)現(xiàn)，C組的平均年齡要比B組高。年齡是影響囊胚形成的因素之一[24]，也同妊娠結(jié)局有關(guān)。本研究的不足在于沒能排除年齡的干擾。

綜上所述，直接凍融可利用囊胚與凍融卵裂期胚胎再培養(yǎng)至可利用囊胚移植的臨床結(jié)局差異無統(tǒng)計學(xué)意義。RACCA 等[25]通過多元Logistic回歸分析允許對相關(guān)混雜因素進(jìn)行調(diào)整，結(jié)果表明冷凍周期中移植的胚胎數(shù)量與活產(chǎn)率不相關(guān)。因此，要盡量減少胚胎移植個數(shù)，降低多胎率的發(fā)生。在凍融周期無可利用囊胚移植的情況下，移植低質(zhì)量囊胚雖然臨床妊娠率稍低，但可減少患者移植周期，避免胚胎的浪費(fèi)。在臨床工作中，應(yīng)權(quán)衡每位患者的胚胎質(zhì)量以及自身?xiàng)l件，在患者知情同意的情況下，選擇最適合的囊胚移植方案。