替格瑞洛改善心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制

陳佩兒 陳燦 何原 莫少門 葉文桃 鐘劍鋒

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院（廣東湛江524001）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，嚴(yán)重威脅著人類的健康[1]。隨著冠狀動(dòng)脈介入手術(shù)（percutaneous coronary intervention，PCI）的開展與藥物溶栓的應(yīng)用，雖大大降低了急性心?；颊叩亩唐诓∷缆?，但卻無(wú)法明顯改善患者的遠(yuǎn)期預(yù)后，其主要原因在于閉塞的冠狀動(dòng)脈再次開通后引起了缺血再灌注損傷（ischemiareperfusion injury，IRI）[2-3]。

再灌注后引發(fā)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致心肌損害的重要因素[4-6]。NF-κB 通路在調(diào)控氧化應(yīng)激和炎癥損傷中起重要作用，在炎癥及腫瘤發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵性的調(diào)控[7-8]。NADPH 氧化酶（NOX）是人血管系統(tǒng)中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要來(lái)源[9]。近年來(lái)研究[10]發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的ROS 主要來(lái)源于NOX4。再灌注后炎癥反應(yīng)能夠上調(diào)心肌細(xì)胞中NOX4的表達(dá)，引起ROS 升高并直接損傷細(xì)胞，而ROS 亦可促使炎癥相關(guān)因子的表達(dá)提高間接地?fù)p傷細(xì)胞。

替格瑞洛（Ticagrelor）是新型P2Y12受體拮抗劑，可以在心腦血管系統(tǒng)中快速地發(fā)揮抗血小板作用[11-12]。替格瑞洛除了作用于P2Y12受體外，還有文獻(xiàn)報(bào)道替格瑞洛具有減輕缺血再灌注損傷的作用，降低心肌細(xì)胞需氧量、提高心肌組織中SOD 活性、抑制中性粒細(xì)胞黏附和減少自由基，改善了缺血再灌注后的心肌損害[13]，而目前其機(jī)制尚未明確。筆者預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示替格瑞洛不僅可以降低炎癥因子的釋放、減輕ROS的生成，還可能抑制NF-κB信號(hào)通路的活化。本實(shí)驗(yàn)旨在探討替格瑞洛是否通過(guò)NOX4/ROS/NF-κB信號(hào)通路軸下調(diào)炎癥因子表達(dá)及減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而改善缺血再灌注相關(guān)的心肌損傷，證實(shí)替格瑞洛治療AMI較氯吡格雷的有效性。

1 材料與方法

1.1 一般材料8～10周齡250～300 g 雄性SD大鼠，由廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。細(xì)胞裂解液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（碧云天，中國(guó)），ELISA 試劑盒（達(dá)科為，中國(guó)），兔抗鼠NOX4 抗體、P-p65 抗體、IκB 抗體、P-IKK抗體（Abcam，美國(guó)），替格瑞洛（Sigma，美國(guó)）。

1.2 動(dòng)物分組與處理利用完全隨機(jī)數(shù)字法將60只250～300 g的雄性SD大鼠分為，Control（N）：對(duì)照組；Sham（S）：缺血再灌注損傷+生理鹽水組；Clopidogrel（C）：缺血再灌注損傷+氯吡格雷組；Ticagrelor（T）：缺血再灌注損傷+替格瑞洛組，每組15只。其中S、C、T組大鼠通過(guò)制備心肌缺血再灌注損傷模型，C、T組大鼠在手術(shù)前灌胃強(qiáng)飼抗血小板藥物，分別給予300 mg/kg（根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度的篩選及文獻(xiàn)報(bào)道[16]）Clopidogrel、Ticagrelor預(yù)處理，連續(xù)7 d，同時(shí)Control組和Sham組大鼠給予同等量的生理鹽水。

1.3 SD大鼠缺血再灌注損傷模型的建立選取約250 g的雄性SD大鼠，用5%水合氯醛麻醉，同時(shí)將自制的專用面罩套住大鼠外呼吸器官，固定好面罩后連接呼吸機(jī)，待呼吸平穩(wěn)后接著在老鼠的胸部上進(jìn)行刮毛備皮，用刀片小心切開大鼠胸前3-4 肋間皮膚，充分暴露大鼠心臟，視野清晰后在左側(cè)肺動(dòng)脈圓錐和左心耳交界下緣2 mm的區(qū)域進(jìn)針，用U型管以壓管的方式活結(jié)結(jié)扎LAD，一般可以看到心肌壞死后變色，大概30～45 min后可以解開活結(jié)開通血管，心臟缺血再灌注損傷的模型即完成。

1.4 SD大鼠內(nèi)眥靜脈血液采取將大鼠放置于木板平面上，用左手的大拇指和食指從上而下輕輕按住大鼠的頭頸部，逐漸將大鼠的眼球突出，右手用鑷子夾起酒精棉球輕輕擦拭大鼠的眼球周圍，再用右手拇指和食指捏住一根已經(jīng)用肝素進(jìn)行過(guò)抗凝的毛細(xì)玻璃管，緩慢插入大鼠的眼睛前下方內(nèi)眥處，可看到血液流入管內(nèi)，然后取抗凝管在毛細(xì)管通道下接血，最后取出毛細(xì)玻璃管。

1.5 ELISA在預(yù)包被的酶標(biāo)板中加入樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃反應(yīng)90 min，不洗；加生物素標(biāo)記抗體，37℃反應(yīng)60 min，0.01 mol/L TBS洗滌3次；加ABC，37℃反應(yīng)30 min，0.01 mol/L TBS洗滌3次；加TMB，37℃反應(yīng)25 min，0.01 mol/L TBS洗滌3次；加入TMB 終止液，波長(zhǎng)A450 測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中各指標(biāo)的濃度。

1.6 總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（FRAP法）在96孔板的每個(gè)檢測(cè)孔中加入180 μL FRAP 工作液；空白對(duì)照孔中加入5 μL PBS；標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)孔內(nèi)加入5 μL 各種濃度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液；樣品檢測(cè)孔內(nèi)加入5 μL 各種樣品作為陽(yáng)性對(duì)照，輕輕混勻；37℃孵育3～5 min后測(cè)定波長(zhǎng)A593測(cè)定。

1.7 Western blot檢測(cè)NOX4/ROS/NF-κB信號(hào)通路軸表達(dá)。提取心臟組織的蛋白質(zhì)，采用BCA 試劑盒（碧云天，中國(guó)）測(cè)量蛋白濃度，計(jì)算上樣量。蛋白電泳后轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉、小鼠一抗4℃孵育過(guò)夜，次日復(fù)溫1 h后孵育二抗2 h后進(jìn)行曝光，用α-tubulin 作為內(nèi)參（稀釋比例1∶1 000，武漢博士德）。采用Image J分析灰度值，以目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism 7 對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組之間總體均數(shù)比較使用單因素方差分析，兩組采用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 用ELISA法檢測(cè)靜脈血相關(guān)炎癥指標(biāo)筆者發(fā)現(xiàn)大鼠在心肌缺血再灌注損傷模型術(shù)前、后連續(xù)7 d 服用替格瑞洛，靜脈血中的炎癥因子水平（IL-1β、IL-6、TNF-α）對(duì)比各組顯著減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。

圖1 替格瑞洛可降低缺血再灌注損傷后炎性因子的積累Fig.1 Ticagrelor can reduce the accumulation of inflammatory factors after ischemia-reperfusion injury

圖2 替格瑞洛干預(yù)處理組纖維面積明顯減少（×200）Fig.2 Ticagrelor can significantly reduce cardiac fibrosis after ischemia-reperfusion injury（×200）

2.2 在心肌缺血再灌注損傷模型后，光鏡下觀察不同處理組心肌組織馬松染色筆者通過(guò)光鏡下觀察心臟Masson 染色發(fā)現(xiàn)（圖2），與正常組（N組）心臟組織相比，生理鹽水組（S組）的心肌纖維化更嚴(yán)重，心肌壞死范圍和面積更大，而氯吡格雷組（C組）的心肌纖維化稍減輕，心肌纖維化面積稍減少，而令人振奮的是，替格瑞洛組（T組）的心肌細(xì)胞纖維化程度更低。

2.3 在心肌缺血再灌注損傷模型后，不同處理組NOX4的表達(dá)水平見圖3，相對(duì)于正常組（N組），生理鹽水組（S組）的NOX4表達(dá)顯著升高（P＜0.001），提示缺血再灌注后心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)被明顯激活，缺血再灌注損傷的替格瑞洛組（T組）和氯吡格雷組（C組）都可以相應(yīng)地減少氧化應(yīng)激相關(guān)因子NOX4的表達(dá)，但是替格瑞洛組相對(duì)于氯吡格雷組的氧化應(yīng)激相關(guān)因子NOX4的表達(dá)相對(duì)更低（P＜0.05）。

2.4 在心肌缺血再灌注損傷模型后，不同處理組FRAP值的水平用FRAP法測(cè)定血漿中總抗氧化能力，在心肌缺血再灌注模型中，術(shù)前連續(xù)7 d服用替格瑞洛組（T組），血漿中總抗氧化能力顯著高于氯吡格雷組（C組），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

圖3 不同處理組NOX4的表達(dá)水平，替格瑞洛組NOX4 明顯較低Fig.3 Ticagrelor can significantly reduce the expression of NOX4

圖4 不同處理組FRAP值的水平，替格瑞洛組總抗氧化水平較高Fig.4 Among the different treatment groups，Ticagrelor had the highest FRAP level

2.5 在心肌缺血再灌注損傷模型后，不同處理組NF-κB信號(hào)通路相關(guān)激活因子表達(dá)情況為了探究替格瑞洛是否通過(guò)NOX4/ROS/NF-κB信號(hào)通路下調(diào)炎癥因子表達(dá)及減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，我們用Western Blot 法檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路的相關(guān)因子。P-p65 主要存在于活化的NF-κB 二聚體中，與正常組對(duì)比，生理鹽水組（S組）和氯吡格雷組（C組）的P-p65表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），而替格瑞洛組與正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明替格瑞洛可以抑制NF-κB信號(hào)通路的活化（圖5A）；如圖5B所示，替格瑞洛處理組（T組）相對(duì)于生理鹽水（S組）、氯吡格雷組（C組）的P-IKK表達(dá)均有明顯降低（P＜0.01），說(shuō)明替格瑞洛可以減少IKK的激活；同時(shí)IκBα是NF-κB信號(hào)通路的抑制因子，當(dāng)缺血再灌注時(shí)IκBα被迅速降解，其表達(dá)可明顯降低（P＜0.001），而替格瑞洛處理組相對(duì)于氯吡格雷組的IκBα表達(dá)相對(duì)降解減少（P＜0.01），提示替格瑞洛可以減輕NF-κB信號(hào)通路的激活，減輕炎癥反應(yīng)（圖5C）。

圖5 Western blot 中不同組別P-p65、P-IKK、IκBα的蛋白表達(dá)水平Fig.5 The protein expression levels of P-P65、P-IKK、IκBα in different groups

3 討論

目前的研究結(jié)果表明，心肌缺血再灌損傷的相關(guān)機(jī)制主要包括鈣超載[14]、pH 快速變化[15]、線粒體功能障礙[16-17]、氧化應(yīng)激反應(yīng)[18]、炎癥損傷[19]及細(xì)胞凋亡[20]等，并且各個(gè)機(jī)制并不是孤立發(fā)生的，而是可以相互之間調(diào)節(jié)的，其中鈣超載以及ROS 產(chǎn)生是缺血再灌注損傷的基石。

NADPH氧化酶在各個(gè)組織中主要存在7種NOX的同功酶[9]，主要包括NOX1～NOX5，DOU X1～X2，而NOX4是存在于缺血再灌注心肌細(xì)胞中的NADPH 氧化酶亞基的主要類型。當(dāng)NOX4 活性顯著增強(qiáng)時(shí)，胞內(nèi)ROS水平顯著升高，導(dǎo)致心肌受損壞死，心臟纖維化面積增大，從而提示NOX4 源性的ROS可通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)參與心肌缺血再灌注損傷的過(guò)程[9-10]。同時(shí)，NF-κB 通路在調(diào)控氧化應(yīng)激和炎癥損傷中也起重要作用。NF-κB家族有5個(gè)主要成員，分別為P50、P52、P65、c-Rel和RelB。這些轉(zhuǎn)錄因子在非激活狀態(tài)時(shí)主要位于細(xì)胞質(zhì)，與其抑制蛋白IκBs（IκBα、IκBβ、IκBε）結(jié)合形成無(wú)活性的三聚體存在細(xì)胞中；當(dāng)受到內(nèi)外因素刺激時(shí)，可激活I(lǐng)κB 激酶（IKK），促使IκB 磷酸化，并被迅速降解，使NF-κB 通路被激活，并進(jìn)入細(xì)胞核與靶基因中相應(yīng)的DNA 結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，隨后啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄[19，21]。特別需要注意的是，NOX4/ROS/NF-κB信號(hào)通路不僅僅是單向進(jìn)行的。在NOX4/ROS/NF-κB信號(hào)通路中，心肌缺血再灌注時(shí)，各種炎癥刺激NOX4的表達(dá)并產(chǎn)生大量胞內(nèi)ROS，同時(shí)促使IKK 激活，促進(jìn)IκB 磷酸化降解而活化NF-κB，而NF-κB的活化將會(huì)上調(diào)表達(dá)大量炎癥因子，進(jìn)而又會(huì)反過(guò)來(lái)繼續(xù)刺激NOX4的表達(dá)及誘發(fā)產(chǎn)生更多的ROS 加劇氧化應(yīng)激損傷，形成NOX4/ROS/NF-κB 正反饋信號(hào)環(huán)，對(duì)心肌造成持續(xù)性、不可逆性的損害。

目前抗血小板藥物主要由TXA2 抑制劑、P2Y12受體拮抗劑以及GPII b/Ⅲa 受體抑制劑、PDEs 抑制劑等組成。噻吩吡啶類如氯吡格雷等藥物主要在血小板壽命期間不可逆地與P2Y12受體結(jié)合，與氯吡格雷不同，替格瑞洛可逆地與受體結(jié)合并表現(xiàn)出快速起效[11]。除了抗血小板作用外，目前的文獻(xiàn)報(bào)道替格瑞洛能改善缺血再灌注后心肌的損傷[13]，主要是通過(guò)調(diào)節(jié)血中的腺苷的水平而發(fā)揮作用[22-23]。張鳳等[24]研究納入125例計(jì)劃接受急診PCI的STEMI患者，隨機(jī)給予替格瑞洛或氯吡格雷治療。在PCI術(shù)前、術(shù)后等不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定Angptl 2（血清血管生成素樣蛋白2）水平。分析結(jié)果提示，替格瑞洛較氯吡格雷有更強(qiáng)降低炎性因子Angptl 2 水平，提高動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。

本研究利用大鼠構(gòu)建心肌缺血再灌注損傷模型，深入探討替格瑞洛的保護(hù)作用及相關(guān)分子機(jī)制。通過(guò)術(shù)前藥物灌胃處理，術(shù)后采集內(nèi)眥血和心臟標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)替格瑞洛更能降低IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥水平（P＜0.05）以及氧化應(yīng)激相關(guān)因子NOX4的表達(dá)水平（P＜0.05）；同時(shí)總抗氧化能力提高和心肌纖維化程度減輕，說(shuō)明替格瑞洛對(duì)缺血再灌注損傷有抗氧化應(yīng)激、抗炎的作用。另外，使用替格瑞洛能降低的NF-κB信號(hào)通路相關(guān)激活因子Phospho-IKK、NF-κB p65 等的表達(dá)水平（P＜0.05），相反NF-κB信號(hào)通路相關(guān)抑制因子IκB的降解減少（P＜0.01），由此看出缺血再灌注損傷后的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)可以誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路的活化，同時(shí)替格瑞洛可以通過(guò)降低NOX4的過(guò)表達(dá)，進(jìn)而減少ROS 生成，抑制IKK的激活，減少IκB的降解，最終將抑制NF-κB信號(hào)通路的活化，減輕炎癥反應(yīng)。

受到各種因素的影響，本實(shí)驗(yàn)仍存在許多不足的地方。由于大鼠的動(dòng)物模型機(jī)體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能收到多種混雜因子和不同的刺激因素交織影響，今后需在體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證替格瑞洛在缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制，同時(shí)需進(jìn)行大樣本的臨床研究，在人體中證實(shí)其抗氧化應(yīng)激、抗炎、減輕缺血再灌注損傷的作用。

冠脈介入手術(shù)聯(lián)合替格瑞洛能夠有效抗氧化應(yīng)激、抗炎、減輕缺血再灌注損傷，減少術(shù)后不良事件，這使得STEMI患者大大獲益。