MT1G在中晚期肝細胞癌組織中的甲基化狀態(tài)及對索拉非尼治療預后的預測價值

（西安交通大學第一附屬醫(yī)院 肝膽外科，陜西 西安 710061）

據全球癌癥統(tǒng)計報告分析，2018年全球新增肝癌患者841 080 例，死亡781 631 例，有近半數患者來自中國[1]，因此我國肝癌的防治形勢十分嚴峻。肝細胞癌是我國常見的肝癌病理類型，早期確診率較低，進入中晚期后由于患者基礎狀況差、缺乏手術指征，導致5年生存率低[2]。分子靶向制劑的出現為中晚期肝細胞癌患者帶來了希望。索拉非尼是一類多激酶、多靶點抑制劑，可靶向抑制Raf 激酶、酪氨酸激酶、絲氨酸/蘇氨酸激酶等[3]。全球多項臨床試驗均證實索拉非尼作為晚期肝癌的一線用藥，可明顯延長患者的生存期[4]。但是長期大量用藥導致患者耐受性降低，從而影響預后，因此如何提高腫瘤細胞對索拉非尼的反應性是醫(yī)學界最新關注的熱點。2016年，SUN 等[5]學者在權威雜志《Hepatology》上發(fā)表了1 篇文章，發(fā)現MT1G 通過抑制鐵死亡，促使肝細胞癌對索拉非尼產生耐藥性。MT1G 是一類具有高度保守結構的小分子蛋白質，通過與金屬離子結合，誘導金屬應答元件，調控相關基因的表達[6]。SUN 等[5]在文章中提出，索拉非尼可通過誘導一類新的細胞死亡途徑——“鐵死亡”發(fā)揮肝細胞癌殺傷作用，而MT1G 是“鐵死亡”過程中重要的調節(jié)蛋白。目前關于MT1G 與肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展的關系報道較少，TCGA 數據庫為尋找有價值的基因提供了重要線索。在本研究首先在TCGA在線數據庫中查詢了MT1G 在肝癌組織中的表達及與患者生存期的關系，以此為基礎，納入在西安交通大學第一附屬醫(yī)院就診，行索拉非尼治療的中晚期肝細胞癌患者作為實驗對象，進一步分析MT1G 與肝細胞癌患者臨床病理特征及索拉非尼治療反應性的關系，為深入了解肝細胞癌對索拉非尼的耐藥機制提供一定的循證醫(yī)學依據。

1 資料與方法

1.1 生物信息學分析MT1G 在肝癌組織中的表達及與預后的關系

利用TCGA 在線網站（http：//ualcan.path.uab.edu/analysis.html）檢索MT1G 在肝癌組織中的表達及與預后的關系。

1.2 標本收集

調取在西安交通大學第一附屬醫(yī)院病理室保存的86 例病理組織蠟塊，包括癌組織和相配對的癌旁組織（距離肝細胞癌組織＞2 cm）。所有蠟塊來自2016年11月—2018年5月在本院接受肝切除術的中晚期肝細胞癌患者。其中，男性75 例，女性11 例；年齡34～81 歲，平均（61.17±12.54）歲。納入標準：①符合手術指征，并手術切除；②術中發(fā)現或術后經病理證實為中晚期肝細胞癌；③符合巴塞羅那肝癌分期（BCLC）B 或C 期，肝功能Child-Pugh 分級為A 或B 級；④術后經影像學檢查未見確切殘留病灶；⑤術后接受索拉非尼治療，且確定治療前無復發(fā)；⑥術前未經放化療及其他系統(tǒng)地抗腫瘤治療；⑦預計生存時間≥3 個月。排除標準：合并其他重要器官功能障礙。本研究中所有病理標本的獲取已獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的審核。

1.3 主要試劑及儀器

Envision 二步法試劑盒（美國Dako 公司），MT1G抗體（英國Abcam 公司），即用型二抗和DAB 試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），TIANamp FFPE DNA Kit（離心柱型）、甲基化特異性聚合酶鏈反應（methylation specific polymerase chain reaction,MSP）試劑盒（北京天根生化科技有限公司），EpiTect Bisulfite Kit（德國Qiagen 公司），5331 型PCR 儀（美國Eppendorf 公司）。

1.4 免疫組織化學法檢測組織MT1G 蛋白

采用常規(guī)Envision 二步法檢測MT1G 蛋白在肝細胞癌組織和癌旁組織中的表達。取病理切片60℃烤箱烘烤2 h，依次用二甲苯（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ）和梯度酒精（無水酒精、95%酒精、85%酒精、75%酒精）各5 min 脫蠟水化，置于檸檬酸鈉緩沖液中加熱進行組織抗原修復，滴加3% H2O2溶液封閉。滴加足量的MT1G 抗體（1 ∶100 稀釋），置于濕盒中4℃孵育過夜，洗滌。滴加即用型二抗，DAB 顯色，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，脫水，中性樹膠封片。室溫下干燥，由2 位以上病理科副主任醫(yī)師盲法閱片。結果判定：以胞漿出現棕色或棕黃色顆粒為陽性染色，少數陽性染色細胞也會出現細胞核著色。胞漿或胞核未出現棕黃色染色則為陰性。

1.5 MSP 檢測MT1G 基因啟動子甲基化狀態(tài)

采用石蠟包埋組織DNA 提取試劑盒（離心柱型）提取肝細胞癌組織DNA，用紫外分光光度計測定DNA 樣本的純度和濃度。取2.0μg DNA 樣本，進行亞硫酸氫鈉修飾和純化。取2.0μl 純化后回收的DNA 樣本進行MSP 擴增。擴增條件：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火60 s，72℃延伸20 s，共計36 個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸5 min，4℃保存。最后進行瓊脂糖凝膠電泳。MSP 引物序列見表1。

表1 MSP 引物序列

1.6 治療及隨訪

所有患者接受外科手術，在切除腫瘤的同時，根據癌栓位置取栓，術中若發(fā)現淋巴結轉移則行淋巴結清掃。術后經主治醫(yī)生評估接受索拉非尼治療。甲苯磺酸索拉非尼片（商品名：多吉美，德國拜耳醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格：200 mg，注冊證號：H20160201）初始口服劑量400 mg/次，2 次/d。因毒副作用酌情減量，發(fā)現疾病進展、復發(fā)、患者不耐受藥物不良反應或死亡時停藥。結合復診病歷或電話對患者或家屬進行隨訪，隨訪時間截至2019年11月。主要研究終點為患者停藥時間，次要研究終點為患者總生存期。疾病進展或復發(fā)時間為患者手術至CT 或MRI 檢查發(fā)現腫瘤復發(fā)或轉移的時間?？偵嫫跒榛颊呤中g至患者死亡或隨訪截止時間。

1.7 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。非正態(tài)分布的計量資料以中位數和四分位數[M（P25，P75）]表示，比較用秩和檢驗；計數資料以以率（%）表示，比較用χ2檢驗；相關性分析用Spearman 法；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學分析

檢索TCGA 數據庫結果顯示，371 例原發(fā)性肝細胞癌組織[5 087.62（2 311.54，11 857.47）]和相配對的癌旁正常肝臟組織[40.21（16.54，986.4）]中MT1G 蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（Z=6 579.571，P=0.000），原發(fā)性肝細胞癌組織低于癌旁正常肝臟組織（見圖1）。另外MT1G 蛋白高表達者和低表達者總生存率分別為13.19%（12/91）和23.72%（65/274），中位生存時間分別為55.0 個月（1.0～117.0 個月）和56.0 個月（1.0～120.0 個月），經Log-rank χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.485，P=0.872）（見圖2）。

圖1 TCGA 數據庫中原發(fā)性肝細胞癌組織與癌旁正常肝臟組織的MT1G 蛋白相對表達量比較 （n=371）

2.2 MT1G 蛋白在肝細胞癌組織和癌旁組織中的表達

經免疫組織化學法檢測，86 例肝細胞癌組織樣本和癌旁組織中MT1G 蛋白陽性表達率分別為34.88%（30/86）和65.51%（56/86），經χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=15.956，P=0.000），肝細胞癌組織低于癌旁組織。見圖3。

圖2 TCGA 數據庫中不同MT1G 蛋白表達水平患者的預后

圖3 MT1G 蛋白在肝細胞癌組織和癌旁組織中的表達（免疫組織化學法×200）

2.3 MT1G 基因啟動子甲基化檢測

經MCP 檢測，肝細胞癌組織和癌旁組織MT1G基因啟動子甲基化率分別為60.46%（52/86）和37.21%（32/86），經χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=9.307，P=0.002），肝細胞癌組織高于癌旁組織。見圖4。

圖4 MT1G 基因啟動子甲基化狀態(tài)

2.4 MT1G 蛋白陽性表達與MT1G 基因啟動子甲基化狀態(tài)的關系

經等級相關性分析，MT1G 蛋白陽性表達率與MT1G 基因啟動子甲基化率呈負相關（rs=-0.787，P=0.000）。

2.5 肝細胞癌組織中MT1G 蛋白表達與臨床病理特征的關系

不同Child-Pugh 分級、BCLC 分期和術前血清甲胎蛋白的肝細胞癌患者腫瘤組織中MT1G 蛋白陽性表達率比較，經χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而不同性別、年齡、肝炎背景、肝硬化病史、腫瘤數目和直徑、手術切除肝段的肝細胞癌患者腫瘤組織中MT1G 蛋白陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征肝細胞癌患者腫瘤組織中MT1G 蛋白陽性表達率比較 例（%）

2.6 肝細胞癌組織中MT1G 蛋白表達與索拉非尼停藥時間、生存時間的關系

所有患者在術后20.0 d（5～52 d）開始服用索拉非尼，中位服藥時間為17.0 個月（1.0～33.0 個月）。MT1G 蛋白陽性表達患者中位停藥時間為15.0 個月（4.0～27.0 個月），MT1G 蛋白陰性表達患者為20.0 個月（1.0～33.0 個月），經Log-rank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=9.248，P=0.002），MT1G 蛋白陽性表達患者停藥時間較短。另外，中位隨訪時間為15.0 個月（4.0～40.0 個月）。見圖5。

圖5 MT1G 蛋白陽性與陰性表達患者的索拉非尼停藥時間比較

隨訪期間，39 例患者死亡，中位生存時間為25.0 個月（4.0～40.0 個月），總生存率為54.65%（47/86）。MT1G 蛋白陽性表達患者中位生存時間為20.0 個月（11.0～38.0 個月），MT1G 蛋白陰性表達患者為25.0 個月（4.0～40.0 個月），經Log-rank χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.717，P=0.190）。同時，MT1G 蛋白陽性表達患者和陰性表達患者總生存率分別為43.33%（13/30）和60.71%（34/56），經χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=2.381，P=0.123）。見圖6。

圖6 MT1G 蛋白陽性與陰性表達患者的生存時間比較

3 討論

根據美國肝病學會診療指南和歐洲肝臟研究學會-歐洲癌癥研究治療組織臨床實踐指南推薦，對于BCLC 分期B、C 期肝癌患者建議實行肝動脈化療栓塞術以延長患者的生存時間[7]。但是在實際臨床中，部分中晚期患者具有良好的肝功能儲備，同樣可采取手術治療。TORZILLI 等[8]對2 046 例中晚期肝癌患者（BCLC 分期B 期737 例，C 期287 例）進行術后隨訪，1年生存率約為70%。雖然手術治療提高了中晚期肝癌患者的1年生存期，但是術后高復發(fā)和高轉移率是導致治療失敗的主要原因。分子靶向制劑的出現為中晚期肝癌患者帶來了曙光。莊磊等[9]通過回顧性研究發(fā)現，中晚期肝癌患者術后使用索拉非尼可明顯延長中位生存時間，取得較為滿意的療效。但是國外一項Ⅲ期臨床試驗卻發(fā)現，索拉非尼在晚期肝癌患者的疾病控制率和總生存期方面獲益不明顯[10]。一方面與部分患者對索拉非尼反應性較低有關；另一方面由于長期大劑量用藥，患者耐受性降低，易產生繼發(fā)性耐藥。因此尋找可預測索拉非尼反應性和耐藥性的敏感標志物是提高患者臨床獲益的關鍵。

SUN 等[5]發(fā)現MT1G 作為一種重要的調節(jié)蛋白，有望成為索拉非尼治療肝細胞癌耐藥的新靶點。MT1G 屬于MT 家族成員之一，由61～81 個氨基酸序列組成，目前已知在肝臟組織和腎臟組織中的相對表達量最高，但是在其他組織中也有表達。本研究結果表明，MT1G 蛋白在肝細胞癌組織中呈低表達，而且與基因啟動子甲基化水平有關。因而筆者推測MT1G基因沉默可能與肝細胞癌的發(fā)生有一定關聯。ZENG 等[11]通過細胞實驗也證實，肝癌細胞HepG2、Hep3B、Bel7402、SMMC7721、MHCC97L、HCC97H中MT1G 基因和蛋白相對表達量均明顯降低，上調MT1G基因表達后，可抑制肝癌細胞的增殖活性，其作用機制可能與調節(jié)基質金屬蛋白酶家族成員及上皮間質轉化進程有關，這與TCGA 數據庫中提供的數據基本一致。

進一步分析MT1G 蛋白與中晚期肝細胞癌患者臨床病理特征的關系，結果表明肝細胞癌組織中MT1G蛋白陽性表達率與Child-Pugh 分級、BCLC 分期、術前血清甲胎蛋白水平有關，筆者推測雖然MT1G基因啟動子發(fā)生甲基化是發(fā)生在細胞癌變的早期階段，但是MT1G不僅具有類癌基因的活性，屬于腫瘤生長抑制因子，還可能與腫瘤的侵襲、轉移也有一定的關系。JI 等[12]也曾證實，MT1G基因甲基化水平可作為篩查肝癌高?；颊叩拿舾兄笜?，特異性和敏感性分別為69.0%和83.8%，均高于血清甲胎蛋白的診斷效能，并且Ⅲ、Ⅳ期患者血清MT1G基因甲基化水平明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者。但是目前關于MT1G 抑制腫瘤細胞侵襲和轉移的機制尚不明確，需要進一步深入研究。

2012年，DIXON 等[13]首次提出“鐵死亡”的概念，與傳統(tǒng)的凋亡概念不同，“鐵死亡”是由于細胞內鐵依賴性脂質過氧化物積累導致細胞收縮，線粒體膜密度升高，最終引起細胞死亡。YUAN 等[14]證實，沉默CISD1基因的表達，可導致細胞內線粒體大量積累活性氧，進而觸發(fā)肝細胞癌“鐵死亡”程序。2012年，CORIAT 等[15]發(fā)現索拉非尼通過誘導肝細胞癌發(fā)生氧化應激反應，分泌活性氧，一方面發(fā)揮腫瘤細胞殺傷作用；另一方面易導致正常細胞內聚集儲存鐵，產生毒副作用；而補充鐵螯合劑可降低索拉非尼毒副反應的發(fā)生率。后來，SUN 等[5]研究證實，上述作用機制與細胞“鐵死亡”有關，屬于非激酶依賴性途徑，另外索拉非尼誘導肝細胞癌鐵死亡的機制取決于MT1G基因甲基化狀態(tài)，上調MT1G基因表達，可增強索拉非尼誘導鐵死亡作用，從而提高治療的反應性。本研究結果也表明，對于肝細胞癌組織MT1G 蛋白陽性表達者，中位生存時間明顯縮短，隨訪3年間總生存率也低于MT1G 蛋白陰性表達者，由于納入的樣本量偏少，最終并未得出統(tǒng)計學差異。

綜上所述，MT1G 蛋白在中晚期肝細胞癌組織中表達降低，與MT1G基因啟動子過度甲基化有關。而且MT1G 是參與索拉非尼誘導肝細胞癌細胞“鐵死亡”過程中的重要分子，MT1G 陽性表達的中晚期肝細胞癌患者接受索拉非尼治療獲益有限，相對陰性表達者預后不良，提示MT1G 有望成為肝細胞癌患者接受索拉非尼治療的潛在預后指標，以及逆轉索拉非尼耐藥的重要分子靶點。但是目前關于“鐵死亡”的作用機制、索拉非尼與“鐵死亡”的關系，以及MT1G 在索拉非尼耐藥性中扮演的角色等問題尚不明確，需要更深入的基礎性研究以支持本文的結論。